SPT3定向进化提高酿酒酵母乙醇耐性的研究

酿酒酵母的乙醇耐性是选育发酵生产燃料乙醇菌种的重要指标，提高酿酒酵母的乙醇耐受性，对于燃料乙醇的发酵生产，尤其是超高浓度乙醇发酵具有重要意义。然而酵母菌的乙醇耐性受多基因调控，难以通过单基因操作得到有效改善。前人利用全局转录工程对酿酒酵母转录复合体TFIID成分SPT15编码基因的代谢工程操作，获得了乙醇耐性明显提高的酿酒酵母突变体。分析表明，SPT15突变蛋白与SAGA复合体成分SPT3相互作用的改变可能是酵母突变体乙醇耐性提高的原因。本文研究了酿酒酵母SPT3的定向进化对酵母细胞乙醇耐性的影响。首先以pYES2.0载体为基础构建了SPT3组成型表达载体，通过易错PCR建立了SPT3突变基因文库，并转化酿酒酵母ATCC4126。从突变酵母转化子中筛选到乙醇耐性提高的酿酒酵母突变株M25，在10％乙醇中培养36h时OD600为对照株的2.6倍，最大菌体浓度为对照株的1.2倍，而在无乙醇培养基中生长速率没有明显改变；利用125g/L的葡萄糖发酵时，M25突变株的终点乙醇浓度比对照株提高了12.5％。对M25突变株的SPT3氨基酸序列分析表明，突变蛋白与TBP结合的N端保守区59位异亮氨酸突变为苏氨酸，推测可能与其乙醇耐性提高有关。乙醇耐性降低的两株突变体M1和M2在无乙醇培养基中生长速率也有所下降，突变株M1的SPT3蛋白C端缩短了85个氨基酸，M2中C端保守区的249位丙氨酸、320位色氨酸发生突变。过量表达SPT3的酵母转化子，其乙醇耐性、生长速率和发酵速率与对照株相比均没有明显改变。 本论文的研究结果表明，SPT3基因的定向进化可用于酿酒酵母乙醇耐性的代谢工程改造，对突变频率、启动子活性和载体拷贝数的优化将可能得到乙醇耐性和发酵速率都提高的酿酒酵母突变体。本文的工作为进一步提高工业酿酒酵母的乙醇耐性，提高燃料乙醇发酵的经济和技术水平奠定了理论基础。