基于IKKε靶点的氨来占诺对非酒精性脂肪性肝病的干预研究

目的：本研究将用高脂饲料诱导非酒精性脂肪肝小鼠模型，同时联合IKKε激动剂LPS加重肝脏负荷，再用IKKε特异性抑制剂氨来占诺分别进行干预，以判断基于IKKε靶点的氨来占诺是否对非酒精性脂肪性肝病具有保护性作用，并对其保护性机制做初步探究。
　　方法：(1)氨来占诺对小鼠非酒精性脂肪肝的疗效评价实验：C57BL/6小鼠40只随机分为四组，即正常对照组（NC组）、高脂组（HFD组）、脂多糖组（HFD+LPS组）、氨来占诺组（HFD+AM组），模型及实验组用高脂喂养18周，HFD+LPS组予以皮下注射125μg/kg/d LPS，HFD+AM予以25mg/kg/d氨来占诺灌胃，摘除小鼠眼球取血后处死，进行指标检测；(2)每周测量各组小鼠体重，于第4周、第8周时代谢笼采集不同组小鼠摄食量；第10周、第18周行糖耐量试验；(3)18周处死小鼠，取肝脏组织行HE、油红O染色；取血清用生化试剂盒检测TG、TC、ALT、AST水平，ELISA法测定血清TNF-α、FFA水平；(4) qPCR法检测肝脏中IKKε、p65、G6P、PCK1、PKLR、FAS、SREBP1、PPARα、CD36的 mRNA的表达，Western blotting法检测肝脏组织IKKε、NF-κB p65的表达。（5）氨来占诺对LPS诱导下的NAFLD的干预作用实验：C57BL/6小鼠30只随机分为三组，即高脂组（HFD组）、脂多糖组（HFD+LPS组）、脂多糖+氨来占诺组（HFD+LPS+AM组），用高脂喂养18周， HFD+LPS+AM予以125μg/kg LPS皮下注射12周后，改为25mg/kg/d氨来占诺灌胃6周，摘除小鼠眼球取血后处死，进行指标检测；(6)每周测量各组小鼠体重，于第18周时代谢笼采集不同组小鼠摄食量；第18周行糖耐量试验；(7)18周处死小鼠，取肝脏组织行HE、油红O染色；取血清检测TG、TC、ALT、AST、 TNF-α、FFA水平；(8) qPCR法检测肝脏中 IKKε、p65、G6P、PCK1、PKLR、FAS、SREBP1、PPARα、CD36的mRNA的表达、Western blotting法检测肝脏组织IKKε、NF-κB p65的表达；(9)最后利用SPSS18.0软件包对各组数据进行统计学分析，P<0.05被认为差异有统计学意义。
　　结果：(1)根据氨来占诺对小鼠非酒精性脂肪肝的疗效评价实验，可以得出AM较HFD组体脂减少明显（p<0.05），LPS增加体脂效应较单纯高脂饲料更强（p<0.05），并且两者影响效应不随食物摄入量改变。(2)肝脏病理学提示AM能减轻肝脏脂肪变性程度，AM组的肝重、肝脏甘油三酯含量较HFD组降低（p<0.05），同时血清甘油三酯、胆固醇水平与HFD组相比下降明显（p<0.05）；LPS则促进肝脏脂肪空泡形成，与 HFD组相比进一步增加肝重（p<0.05）、肝脏甘油三酯含量（p<0.05），增加血甘油三酯含量（p<0.05），但不影响血清ALT、AST水平（p>0.05）；(3) AM减少HFD引起的高血糖，第10周时OGTT2h、3h血糖较HFD组降低（p<0.05），但曲线下面积无差异（p>0.05）；第18周时OGTT1h、2h、3h血糖及曲线下面积较HFD组降低（p<0.05），血清胰岛素水平和胰岛素抵抗程度均较HFD组下降（p<0.05）；LPS组较HFD组进一步加重OGTT1h（第10周），OGTT0h、1h、2h（第18周）血糖，增加血糖曲线下面积（p<0.05）；LPS组与HFD组相比不影响空腹血胰岛素水平（p>0.05），但加重胰岛素抵抗程度（p<0.05）；(4) AM减少HFD引起的高TNF-α、高FFA水平（p<0.05），LPS则进一步增加了TNF-α、FFA水平（p>0.05）。(5)根据氨来占诺对LPS诱导下的NAFLD的逆转作用实验，可以得出HFD+LPS+AM组体重从13周起明显低于HFD+LPS组（p<0.05），且该作用并不取决于对食欲的影响；(6)肝脏病理学提示HFD+LPS+AM组肝脏脂肪变性和脂肪空泡较HFD+LPS组明显减少（p<0.05）， AM能减少HFD+LPS诱导下的肝重、肝脏甘油三酯含量、高脂血症，但不改变血清ALT、AST水平（p>0.05）；(7) AM可降低HFD+LPS组诱导的1h、2h、3h的血糖值，曲线下面积较 HFD+LPS组也减少（p<0.05），同时 HFD+LPS+AM组胰岛素水平较HFD+LPS组降低，胰岛素抵抗程度得到缓解（p<0.05）；(8) AM可减少HFD+LPS诱导和加重的血清高FFA、TNF-α水平（p<0.05）；(9)疗效机制方面，AM能从mRNA和蛋白层面减少HFD组、HFD+LPS组的IKKε、p65水平（p<0.05）。同时AM能降低HFD组、HFD+LPS组的高 FAS、SREBP1、CD36水平（p<0.05），而PPARα在HFD组与HFD+AM组间无差异（p>0.05）。AM能同时降低HFD组、HFD+LPS组的G6P、PKLR水平（p<0.05），但对HFD组的PCK1无抑制作用（p>0.05）。
　　结论：(1)氨来占诺通过改善胰岛素抵抗、减轻肝脏炎性反应、恢复肝脏脂质代谢平衡而缓解了NAFLD的发生发展，同时也能逆转NAFLD的疾病状态。(2)氨来占诺主要通过减少脂肪合成，减少糖异生、糖酵解的作用而缓解了糖脂代谢紊乱。