五甲基槲皮素对非酒精性脂肪肝病的作用及机制

随着肥胖患病人群的快速增长，非酒精性脂肪肝病已成为常见的慢性肝病之一，其发生机制和干预措施备受关注。槲皮素是一种天然黄酮类化合物，已有研究表明槲皮素可改善非酒精性脂肪肝脏病变。五甲基槲皮素（Pentamethylquercetin，PMQ）是天然多甲氧基黄酮家族的成员之一，存在于沙棘等天然植物中，本实验室对槲皮素结构进行全甲基化修饰得到的PMQ相比槲皮素具有明显的药代动力学优势。PMQ已被证实的药理作用包括抗心肌肥厚、抗代谢综合征、抗链脲霉素诱导的糖尿病等，而PMQ对非酒精性脂肪肝病的作用尚有待深入探讨。本研究选用谷氨酸钠（Monosodium glutamate，MSG）诱导的肥胖小鼠非酒精性脂肪肝病模型以及棕榈酸（Palmitic acid，PA）诱导的L02细胞脂肪变性模型，探讨PMQ对非酒精性脂肪肝脏病变的作用及机制。
　　第一部分、五甲基槲皮素改善MSG肥胖小鼠非酒精性脂肪肝脏病变的作用及机制
　　目的：研究PMQ对MSG诱导的肥胖小鼠非酒精性脂肪肝脏病变的作用及机制。
　　方法：选用健康CD-1小鼠雌鼠和雄鼠各若干只（10周龄），适应性喂养2周；至12周龄时，按一雄两雌进行配种。乳鼠出生后第2天起，连续7天皮下注射MSG造模，正常对照组（Control）皮下注射等体积生理盐水；3周龄时断乳分笼，5周龄时选取雄性 MSG造模小鼠进行随机分组，每组10只：溶剂对照组（Vehicle），低、中、高剂量PMQ组（PMQ5、10、20mg/kg），阳性药物对照组（二甲双胍，MET300mg/kg），分别予以灌胃给药，每天一次，直至小鼠满24周龄。每周定期称量小鼠体重，至小鼠22周龄时进行口服葡萄糖耐量实验；24周龄时测量各组小鼠体重、腰围，经眼眶静脉丛采血后处死动物，获取相应组织器官。检测血清血糖、胰岛素、甘油三酯（Triglyceride，TG）、总胆固醇（Total cholesterol，TC）、血清谷草转氨酶（Serum Aspartate aminotransferase，AST），血清谷丙转氨酶（Serum Alanine aminotransferase，ALT）水平，检测肝脏TG和TC含量；行肝脏组织病理切片进行HE染色、油红O及Masson三色染色；RT-PCR方法检测肝脏相关基因的表达水平；Western blot方法检测肝脏相关蛋白的表达水平。
　　结果：
　　1）与Control组相比，MSG组小鼠明显肥胖，体重、腰围、Lee指数显著增加；糖脂代谢出现异常，表现为空腹血糖、血清胰岛素、胰岛素抵抗指数、血清TG及TC水平显著上升；肝脏油红O和HE染色显示有脂质蓄积和肝细胞脂肪变性，Masson三色染色显示无明显纤维化改变；肝脏TG和TC含量显著增加，血清ALT和AST水平明显升高。
　　2）与Vehicle组比，各剂量PMQ给药组小鼠肥胖状态得到明显改善，体重、腰围、Lee指数显著下降；空腹血糖、血清胰岛素、胰岛素抵抗指数、血清TC、TG、LDL-C水平以及血清 ALT、AST水平显著降低；肝脏TG和TC含量显著下降；肝脏油红O和HE染色显示脂质聚集明显减少，肝细胞脂肪变性缓解；PMQ各剂量组肝脏PGC-1α mRNA表达水平明显升高，FASN、CD36 mRNA水平也不同程度地下降；PMQ可显著上调Sirt6 mRNA和蛋白表达水平，增加肝脏 p-AMPK蛋白表达，显著下调 SREBP-1c、SREBP-2、PCSK9 mRNA水平。
　　第二部分、五甲基槲皮素改善棕榈酸诱导的L02细胞非酒精性脂肪变性的作用及机制
　　目的：研究PMQ对PA诱导的L02细胞非酒精性脂肪变性的作用机制。
　　方法：培养L02细胞，筛选出既不影响细胞活力又可降低细胞葡萄糖消耗的PA浓度，以此浓度PA制备L02细胞脂肪变性模型。用96孔板培养L02细胞，用含10％胎牛血清的1640完全培养基培养24h后换成含1%胎牛血清的1640培养基培养12h以同步化，再换为含DMSO、PMQ（1、3、10μM）以及MET（100μM）的1640培养基（含一定浓度PA）继续培养，并加设不含PA的DMSO对照组。细胞培养24h后，检测细胞活力、细胞葡萄糖消耗量、TG含量；RT-PCR方法检测FASN和CD36 mRNA表达水平；Western blot方法检测Sirt6蛋白水平。
　　结果：1）与对照组相比，PA组细胞葡萄糖消耗下降、细胞TG含量升高，FASN、CD36 mRNA表达水平增加，Sirt6蛋白水平下降。
　　2）与PA组相比，PMQ剂量依赖性地增加细胞葡萄糖消耗量，降低细胞 TG含量；高浓度 PMQ显著降低FASN、CD36 mRNA的表达水平，上调Sirt6蛋白表达。
　　结论：PMQ可明显改善MSG肥胖小鼠的代谢综合征和非酒精脂肪肝脏病变，改善PA诱导的L02细胞糖脂代谢异常和脂质蓄积。上调Sirt6，激活AMPK/SREBP和抑制PCSK9可能是PMQ发挥抗非酒精性脂肪肝脏病作用的重要机制之一。