辛伐他汀抑制酒精诱导大鼠骨髓基质细胞成脂及促进成骨的实验研究

研究目的： 酒精性股骨头坏死(osteonecrosis 0fthe femoral head，ONFH)发病率高。目前，酒精性ONFH早期病例采取保守治疗，晚期病例行人工髋关节置换术。但是，保守的疗法效果差，许多患者只能是减轻关节疼痛，推迟行人工关节置换的年龄，而无有效的方法治愈早期病例，从而避免行人工关节置换。手术疗法有很多并发症，而且目前的人工关节寿命在15-20年，对于年轻患者在一生中常不可避免地要进行人工关节翻修，第二次行人工关节置换术，带来很多痛苦和不便，因此寻找一种能够有效治疗酒精性ONFH的保守疗法是众多学者研究的方向。以前的研究表明酒精可诱导骨髓基质细胞(marrow stromal cells，MSCs)成脂分化而抑制成骨分化，是酒精性ONFH的重要发病机制，而且针对此发病机制的保守疗法研究取得了一定的成果。因此，本研究拟采用体外原代培养MSCs技术，建立酒精诱导MSCs成脂分化的细胞模型，从细胞形态学、生物化学及分子生物学等方面，观察辛伐他汀(simvastatin)抑制酒精诱导的MSCs成脂作用和辛伐他汀促进MSCs成骨分化的作用，以探讨辛伐他汀治疗酒精性股骨头缺血性坏死的可能。 方法： SD大白鼠(雄性，6周龄，由河南省实验动物中心提供)，获取贴壁生长的MSCs。待原代细胞长至融合后传代，细胞以1×10<'4>个/ml接种，继续培养。逐日用倒置显微镜观察MSCs的形态及生长情况。以第二代细胞于接种R分组，并将接种日作为实验观察的0日。实验样本采用随机法分为3组：对照组(N)、模型组(M)和实验组(S)。对照组以不加酒精及辛伐他汀的培养液培养，模型组在实验周期的前半程以含浓度为0.09mol/L酒精的培养液培养，后半程停加酒精；实验组在实验周期的前半程以含浓度0.09mol/L酒精的培养液培养，后半程停加酒精，改以含浓度1×10<'-7>mol/L辛伐他汀的培养液培养。逐日用倒置相差显微镜观察MSCs的形态及生长情况。观察内容：以第二代细胞接种于6孔培养板中，培养的第14天以相关试剂盒检测细胞24h骨钙素(osteocalcin，OC)分泌量、细胞的碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性；培养的第21天对细胞苏丹Ⅲ染色，进行脂肪细胞计数，以相关试剂盒检测细胞的甘油三酯(triglyeride，TG)含量；以第二代细胞接种于100ml培养瓶中，培养的第14天以逆转录聚合酶链扩增反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain ReactionRT-PCR)技术检测成脂基因过氧化物酶体增殖子活化受体-γ(peroxisomeproliferator-activated receptor-γ，PPAγ)，成骨基因OC、骨形态发生蛋白-2(bonemorphogenetic protein-2，BMP-2)和核心结合因子al(core binding factor-al，Cbfal)的基因表达水平。统计学处理：实验数据采用均数±标准差(x±S)表示，实验数据采用SPSS10.0软件进行统计学分析，多组间比较采用单因素方差分析，样本均数间的两两比较采用LSD-t检验，检验水准a=0.05。 结果 1.脂肪细胞数：实施处理因素后第21天，与对照组比较，模型组中脂肪细胞数较多，差异有统计学意义(P<0.05)；与对照组比较，实验组的脂肪细胞数稍多，差异无统计学意义(P>0.05)，实验组和对照组脂肪细胞数均少于模型组脂肪细胞数，差异有统计学意义(P<0.05)。 2.细胞内TG含量：实施处理因素后第21天，与对照组比较，模型组细胞内甘油三酯含量明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与对照组比较，实验组细胞内甘油三酯含量稍高，差异无统计学意义(P>0.05)，实验组和对照组细胞内甘油三酯含量均低于模型组细胞内甘油三酯含量，差异有统计学意义(P<0.05)。 3.细胞分泌的OC量：实施处理因素后第14天，与对照组比较，模型组细胞分泌的OC量明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)；与对照组比较，实验组细胞分泌的OC量稍低，差异无统计学意义(P>0.05)，实验组和对照组细胞分泌的OC含量均高于模型组细胞分泌的OC量，差异有统计学意义(P<0.05). 4.细胞ALP活性：实施处理因素后第14天，与对照组比较，模型组细胞内ALP活性明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与对照组比较，实验组细胞内ALP活性稍低，差异无统计学意义(P>0.05)，实验组和对照组细胞内ALP活性均高于模型组细胞内ALP活性，差异有统计学意义(P<0.05)。 5.PPAR γ mRNA的表达：实施处理因素后第14天，与对照组比较，模型组细胞PPARymRNA表达水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与对照组比较，实验组细胞PPARγmRNA表达水平稍高，差异无统计学意义(P>0.05)；实验组和对照组细胞PPAγmRNA表达水平均低于模型组细胞PPAγmRNA表达水平，差异有统计学意义(P<0.05)。 6.OC mRNA的表达：实施处理因素后第14天，与对照组比较，模型组OCmRNA表达水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与对照组比较，实验组OC mRNA表达水平稍低，差异无统计学意义(P>0.05)；实验组和对照组细胞OC mRNA表达水平均高于模型组细胞OC mRNA表达水平，差异有统计学意义(P<0.05)。 7.BMP-2 mRNA的表达：实施处理因素后第14天，与对照组比较，模型组BMP.2 mRNA表达水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与对照组比较，实验组BMP-2 mRNA表达水平稍低，差异无统计学意义(P>0.05)；实验组和对照组细胞BMP-2 mRNA表达水平均高于模型组细胞BMP-2 mRNA表达水平，差异有统计学意义(P<0.05)。 8.Cbfal m：RNA的表达：实施处理因素后第14天，与对照组比较，模型组Cbfal mRNA表达水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与对照组比较，实验组Cbfa 1 m.RNA表达水平稍低，差异无统计学意义(P>0.05)；实验组和对照组细胞Cbfal mRNA表达水平均高于模型组细胞Cbfal mRNA表达水平，差异有统计学意义(P<0.05)。 结论： 在体外实验研究中，辛伐他汀能够有效地抑制酒精诱导的SD大白鼠MSCs成脂分化，促进SD大白鼠MSCs成骨分化。提示在体机内辛伐他汀可能具有阻止MSCs向脂肪细胞分化而降低骨内压、增加MSCs成骨分化而促进骨重建的作用，对酒精性股骨头坏死有一定的治疗作用。