ARO9、ARO10基因过量表达对Saccharomyces cerevisiae产3-甲硫基丙醇代谢调控的影响

3-甲硫基丙醇是我国芝麻香型白酒的特征性香物质，也是多种食品的重要香气组分，天然存在于葡萄酒、啤酒、酱油、奶酪、番茄和土豆中。3-甲硫基丙醇的香气阈值低，在食品中建议用量为0.1-10mg/kg，其风味依次呈现麦芽香味、香油味和熟土豆味。本文拟通过构建酿酒酵母菌株代谢网络，进行代谢通量分析预测目标基因，采用基因工程手段改造菌种并进行发酵验证，为获得高产3-甲硫基丙醇的基因工程菌株奠定基础。通过研究，主要得到以下结果：
　　1.在营养缺陷型酿酒酵母INVSc1中，过量表达转氨酶(EC2.6.1.58)基因ARO9，分析发酵液中3-甲硫基丙醇的产量是否提高来验证克隆基因的功能。将ARO9基因与穿梭质粒pYES2连接，构建酿酒酵母表达质粒pYES2-ARO9，经测序验证后，使用醋酸锂方法转化酿酒酵母菌株INVSc1中进行表达，验证ARO9基因过量表达对发酵产物3-甲硫基丙醇影响。结果表明，构建的酿酒酵母转化子SC09-1发酵120h时，其生成量比未导入的对照菌株，其3-甲硫基丙醇产量提高16.1％。因此，S.cerevisiaeS288C中转氨酶(EC2.6.1.58)是3-甲硫基丙醇生物合成途径的关键限速酶，其增强转氨酶基因ARO9的克隆及基因表达，有利于提高3-甲硫基丙醇的合成代谢流量。
　　同理，将脱羧酶基因ARO10与穿梭质粒pYES2连接，构建了酿酒酵母表达质粒pYES2-ARO10。经测序验证后，使用醋酸锂方法转化到INVSc1中进行表达，对发酵产物进行检测，结果表明，构建的酿酒酵母转化子SC10-1能够过量生产3-甲硫基丙醇，发酵120h时，其生成量比未导入的对照菌株，其3-甲硫基丙醇产量提高55.2%。因此，S.cerevisiaeS288C中脱羧酶(EC4.1.1.72)是3-甲硫基丙醇生物合成途径的关键限速酶之一，过表达脱羧酶基因ARO10，有利于提高3-甲硫基丙醇的合成代谢流量。
　　2.在原养型酿酒酵母S288C中，分别过表达转氨酶基因（ARO9）和脱羧酶基因（ARO10），获得相应转化子GSO9和GSO10；并对已构建成功的基因工程菌株GSO9、工程菌株GSO10和宿主菌S288C进行摇瓶发酵实验。
　　发酵结果表明：当发酵85h时，工程菌株GSO9的3-甲硫基丙醇生成量基本稳定，最大生成量为1.07g/L，对照菌株S288C中3-甲硫基丙醇的最大生成量0.97g/L，工程菌株GSO9发酵过程中，3-甲硫基丙醇的生成量比对照菌株S288C提高10.3%。当发酵95h时，工程菌株GSO10的最大生成量为1.23g/L，对照菌株S288C中3-甲硫基丙醇的最大生成量1.02g/L，在工程菌株GSO10发酵过程中，3-甲硫基丙醇的生成量比对照菌株S288C提高20.6%。上述研究为进一步高产3-甲硫基丙醇的酿酒酵母基因工程菌株的代谢通量分析提供材料和根据。
　　3.基于构建的代谢网络，对酿酒酵母S288C和两株过表达工程菌株GSO9和GSO10，进行了代谢通量分析，研究了分别过表达酿酒酵母自身的转氨酶（EC2.6.1.58）和脱羧酶（EC4.1.1.72）对碳代谢流进入戊糖磷酸途径、糖酵解途径、三羧酸途径和3-甲硫基丙醇生成特征途径的通量变化，结果表明：在工程菌株GSO9和GSO10的代谢通量分布中，戊糖磷酸途径的通量、蛋氨酸降解和Ehrlich途径上的代谢通量得到提高，3-甲硫基丙醇的理论得率与实验检测值相符合。本实验为进一步构建稳定高产3-甲硫基丙醇的酿酒酵母工程菌提供了参考。