表达纤维素酶基因的酿酒酵母菌株构建及其底物利用评价

全球化石燃料储量的日益减少以及人类所面临的能源、资源、环境问题,使发展可再生替代燃料特别是纤维素乙醇的意义越来越重要。使用传统的乙醇发酵工业用微生物—酿酒酵母来表达纤维素酶、直接利用纤维素产醇,是纤维素乙醇一个重要的研发方向。内切葡聚糖酶(EG)是纤维素酶酶系的关键组分之一,同时也是木质纤维素底物酶解过程中降粘的主要成分。
　　本研究首先考察影响EG基因高效表达的因素,从而确定优化的表达方式。通过PCR首先克隆得到了棘孢曲霉egl1全长基因,在经测序并鉴定出它含有2个内含子和3个外显子的基础上,再通过PCR添加相应的表达元件—酿酒酵母tpi启动子、瑞氏木霉木聚糖酶II分泌肽xyn2s和酿酒酵母adhI终止子,分别构建了带锚定肽和不带锚定肽的两种基因表达盒;同样地,对瑞氏木霉 egl2也构建了这两种类型的表达盒。将上述构建的四种基因表达盒分别连接至低拷贝穿梭质粒载体YCplac33和高拷贝穿梭质粒载体YEplac195上并转化酿酒酵母W303a菌株,获得8个具有内切葡聚糖酶活力的重组酿酒酵母工程菌株。葡萄糖培养基上的生长曲线显示:8个重组菌株与对照菌株的生长没有明显的差别;葡萄糖培养基中的酶活测定及羧甲基纤维素钠(CMC)培养基中的降粘实验结果显示:含瑞氏木霉来源EGII基因的ORF框、YEplac195为载体、不带锚定肽的构建即YE-TrEGII’菌株的表达效果最佳,48 h酶活为6.0 U/ml,12 h培养液的粘度值降至新鲜 YP-CMC培养基粘度值的4.7％;含瑞氏木霉来源 EGII的ORF框、YCplac33载体、带锚定肽的构建即YC-TrEGII菌株的表达效果最差,48 h酶活为0.6 U/ml,12h培养液的粘度值是新鲜YP-CMC培养基粘度值的26.2%。
　　为了实现从纤维素底物直接发酵产醇,利用酿酒酵母染色体重复序列δ序列作为多拷贝整合位点,构建了含有上述优化表达盒(即瑞氏木霉EGII基因、不含锚定肽)的整合载体pGEM-T easy-delta-LEU-Tr EGII’,单独或与实验室已经构建的棘孢曲霉β-葡萄糖苷酶基因BGL1整合载体pGEM-T easy-delta-URA-Aa BGL1’一起进行转化,最终从宿主为W303a(delta::URA-Aa BGL1’)的转化子中筛选得到一株酶活水平和产醇能力相对较为突出的的整合菌株delta1,葡萄糖培养24 h后的EG和BG酶活分别为1.76 U/ml和0.83 U/ml,1%CMC培养基中高密度发酵6天后检测到1.1 g/l的乙醇产生。