啤酒麦芽极限糊精酶、蛋白抑制因子分离纯化及其两者相互作用的研究

极限糊精酶作为影响生产高发酵度、淡爽型啤酒的关键因素，在啤酒酿造中起着举足轻重的作用。本研究对澳麦201106Gairdner绿麦芽中的极限糊精酶及其抑制因子进行了分离纯化，并对其两者性质作了初步研究。同时，在离体的缓冲液体系中，初步探讨了两者之间的相互作用及还原剂DTT作用结合态极限糊精酶释放自由态酶的机制。该研究不仅为获得较高纯度极限糊精酶及其抑制因子提供了有力的理论依据和可行的工艺方法，亦为国内针对性地深入研究啤酒麦芽极限糊精酶性质提供了丰富的研究材料，还为啤酒糖化过程实现酶调控技术提供了可靠的理论基础。
　　采用25％-35%-80%硫酸铵三步盐析、Sephadex G-25凝胶过滤柱层析、DEAE sepharose FF离子交换柱层析和Sephadex G-100凝胶过滤柱层析，纯化得到麦芽极限糊精酶，经 SDS-PAGE和 IEF凝胶电泳检测为单一条带，证明获得了极限糊精酶纯品，分子量大约为101.9kDa，等电点pI约为4.66；将每一步分离纯化得到的蛋白质样品，以酪蛋白为标准，依据福林-酚法测定蛋白质含量，同时以染色底物红普鲁兰法测定酶活力，计算各步骤的比活力、收率和纯化倍数，最终极限糊精酶的纯化倍数为164.2，回收率为16.5%。
　　对麦芽极限糊精酶的酶学性质研究发现，其最适作用温度为50℃，热敏感，当温度超过50℃时，酶活力迅速下降；最适pH在5.5左右，当pH低至4.5时酶活力损失40%以上，在pH5.0-9.0的范围内基本保持稳定；此外，Ca2+、Mg2+、Mn2+等金属离子对该酶有显著的激活作用，尤其是工业中常用的淀粉酶保护剂Ca2+，在80℃下对极限糊精酶有良好的保护作用；对该酶的动力学性质研究表明，以支链淀粉为底物，该酶的Km值为3.3426mg/mL，最大反应速度 Vmax值为0.8456mg/minmL。
　　采用粗提取、热提取、羧甲基纤维素CM-52离子交换柱层析和Sephadex G-100凝胶过滤柱层析，纯化得到两种极限糊精酶抑制因子混合物，分子量相近大约为15.8kDa，等电点pI分别约为6.76和7.28，纯化倍数为39.9，回收率为14.1%。
　　对麦芽极限糊精酶抑制因子的性质研究发现，其对极限糊精酶的抑制最适pH近5.5，其在广泛的pH范围（pH4.0-8.0）内对极限糊精酶均有抑制作用；在温暖（40℃）的环境中，有牛血清白蛋白（BSA）和还原剂DTT存在时，无活性的极限糊精酶可恢复其活性，保温8h，活性可恢复约66.5%。
　　在离体条件下对极限糊精酶调控机制的研究发现，在温暖（40℃）的环境，有牛血清白蛋白（BSA）存在的缓冲液体系中，还原剂DTT可使结合态极限糊精酶活力有一定程度的恢复；自由态极限糊精酶不是“巯基酶”；在离体的缓冲液体系中，推测出一种还原剂DTT作用结合态极限糊精酶释放自由态的假设，即 DTT通过作用于被牛血清白蛋白（BSA）激活或修饰的结合态极限糊精酶，将其还原成自由态极限糊精酶。