不同来源空肠弯曲菌在4℃饥饿条件下能否进入活的但非可培养状态及其形态随时间的改变

目的:
　　1.本实验室保存的不同来源空肠弯曲菌在4℃饥饿条件下在35天的观察期内能否进入活的但非可培养状态。
　　2.观察本实验室保存的不同来源空肠弯曲菌在4℃饥饿条件下在35天的观察期内其革兰染色形态随时间的变化。
　　方法:
　　1.空肠弯曲菌菌株的复苏和传代:取自神经病学实验室（河北医科大学第二医院）-80℃冰箱中保存的格林-巴利综合征患者分离培养出的空肠弯曲菌菌株LC株，lulei株，由鸡粪便中分离培养出的chicken株和非GBS源的NCTC11168株，待冻存的菌株自然消融后，接种于哥伦比亚血平板（含7％无菌脱纤维羊血）上，放置于42℃微需氧(10％CO2、5％O2、85％N2)条件的三气培养箱中，所有菌株培养24小时对应的P1代菌株回收，取P1代菌落三区划线接种于含7％无菌脱纤维羊血的哥伦比亚血平板上，放置于三气培养箱，42℃微需氧(10％CO2、5％O2、85％N2)条件下，培养24小时获得各菌株相应的P2代菌株，取P2代菌落三区划线接种法接种于含7％无菌脱纤维羊血的哥伦比亚血平板培养基上，置于三气培养箱，42℃微需氧(10％CO2、5％O2、85％N2)条件下，培养24小时得到各菌株相应的P3代菌株。
　　2.鉴定空肠弯曲菌:革兰染色法显示菌株为革兰阴性杆状菌，马尿酸水解试验结果显示为阳性。
　　3.收菌用无菌接种环分别刮取4株空肠弯曲菌少量P3代细菌于盛有3ml PBS（PH为7.2+-0.1）液的无菌西林瓶内，振荡器振荡充分摇匀制成菌悬液，每株菌株做4个备份菌悬液并做好记号，所有的菌悬液浓度用细菌浊度仪定量在3*108 cfu/ml。
　　4.饥饿状态:将上述盛有菌悬液的无菌西林瓶置于4℃冰箱内，不需要振荡。
　　5.分别在菌悬液置于冰箱内的第0天，第5天，第10天......用CTC-DAPI双染法计数总的细菌数，活细菌数，平板直接计数法(HPC)计数可培养细菌数。分别对每株空肠弯曲菌的一个备份同时计数总细菌数，活细菌数及可培养细菌数。
　　6.平板直接计数法用无菌双蒸水连续稀释的菌悬液样本(0.1ml)一式三份接种到含7％无菌脱纤维羊血的哥伦比亚血平板培养基上。微需氧(10％CO2、5％O2、85％N2)42℃条件下孵育48h，计数在适当的稀释度下的CFUs，并可以计数原来起初的样本中的CFUs。当可培养细胞少于300/ml时，0.1ml水样本涂布在10个含5％马血的哥伦比亚血平板培养皿上。
　　7.CTC-DAPI双染法在相应的时间点，取出来自空肠弯曲菌悬浮液中的样本并根据Cappelier et al.(1997)技术用CTC和DAPI染色细胞。为了激发细胞呼吸，0.5ml脑心浸液和100μl的0.05g/mL丙酮酸溶液加入到要进行分析的0.5ml菌悬液中。CTC用双蒸水稀释到最终浓度即5mmo l/L，然后混合液在微需氧42℃下孵育4h。接着细胞会经多聚黑碳膜过滤（0.2μm/孔，直径25mm），并用5μg/mL DAPI液覆盖5min，目的是复染。最后，染色剂会被真空抽滤，在盖玻片盖上前会滴上非荧光的油。405nm的激发滤光片和455nm二色镜的Olympus BX53荧光显微镜来观察，这样可以同时看到这两种染色。随机计数每个滤片的20个显微视野。每个样本，计数4个滤片。呼吸的细胞计数RCCs显示CTC甲腊晶体，总细胞计数TCCs是用DAPI染色的。结果可以换成相应的原始样本中每mL细菌数，并可以计算出RCCs和TCCs的比例。实验一式三份进行。
　　8.根据菌株的状态计数（细菌总数，和培养的菌数的活菌数）绘制随时间变化的曲线，当平板计数(HPC)计数活细胞数不为零时，细菌便进入了VBNC状态。
　　9.相应时间点，取平板计数法后平板上生长的单菌落，进行革兰染色。在相应的时间点，于干净的载玻片上滴一小滴生理盐水，用接种环挑取单菌落于生理盐水中涂布均匀;自然干燥室温;在酒精灯火焰幻灯片固定3～4次，每次1～2S;将载玻片置于支架上，顺次使用结晶紫1min，自来水冲刷，卢戈氏碘液1min，自来水冲洗，95％酒精脱色0.5min，自来水冲洗，稀释复红1min，自来水冲洗（每次自来水充分冲洗）。于室温自然干燥后用1000倍油镜观察。
　　结果:
　　1.检测的4株空肠弯曲菌菌株在35天观察期均进入了活的但非可培养(VBNC)状态。
　　2.空肠弯曲菌lulei菌株的VBNC状态在饥饿20天后进入了活的但非可培养(VBNC)状态。
　　3.空肠弯曲菌11168，lc，chicken菌株VBNC状态在25天后进入了活的但非可培养(VBNC)状态。
　　4.被观察的4株空肠弯曲菌显示出了空肠弯曲菌在4℃PBS液中出现不同形态改变。空肠弯曲菌11168，chicken，LC菌株在25天的观察期其形态经历了杆状与球状相互转化，空肠弯曲菌11168菌株在第0天革兰染色呈现出红色杆菌，到第11天可见到大部分革兰染色呈现出红色球菌，第21天开始革兰染色呈现出红色杆菌。空肠弯曲菌Lc菌株在第0天革兰染色呈现出红色杆菌，在第10天开始革兰染色呈现出红色球状，第14天革兰染色呈现出红色短杆状菌，第20天革兰染色呈现出红色杆菌。空肠弯曲菌chicken菌株在第0天革兰染色呈现出红色杆菌，在第15天变革兰染色呈现出红色球菌，第20天杆菌。空肠弯曲菌Lulei菌株在第0天革兰染色呈现出红色杆菌，在第11天革兰染色呈现出紫色球菌。
　　结论:
　　1.检测的4株空肠弯益菌菌株在35天观察期均进入了活的但非可培养(VBNC)状态。其中空肠弯曲菌lulei菌株的VBNC状态在饥饿20天后进入了活的但非可培养(VBNC)状态。空肠弯曲菌11168，lc，chicken菌株VBNC状态在25天后进入了活的但非可培养(VBNC)状态。
　　2.空肠弯曲菌11168，chicken，LC菌株在25天的观察期其形态经历了杆状与球状相互转化，空肠弯曲菌11168菌株在第0天革兰染色呈现出红色杆菌，到第11天可见到大部分革兰染色呈现出红色球菌，第21天开始革兰染色呈现出红色杆菌。空肠弯曲菌Lc菌株在第0天革兰染色呈现出红色杆菌，在第10天开始革兰染色呈现出红色球状，第14天革兰染色呈现出红色短杆状菌，第20天革兰染色呈现出红色杆菌。空肠弯曲菌chicken菌株在第0天革兰染色呈现出红色杆菌，在第15天变革兰染色呈现出红色球菌，第20天杆菌。空肠弯曲菌Lulei菌株在第0天革兰染色呈现出红色杆菌，在第11天革兰染色呈现出紫色球菌。