Shp2在口腔鳞癌中的表达及对其生物学行为的影响

目的:
　　头颈部鳞状细胞癌（Head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）主要影响口腔、舌咽、口咽、喉部及涎腺等，在常见的恶性肿瘤类型中位居第六，而口腔颌面部恶性肿瘤中约80％以上为口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)。尽管近几年我们在OSCC的治疗以及发病机制研究方面取得了一定的进展，但是在过去的几十年中其存活率仍没有明显改善，平均每年确诊的病例中仍有约50％的死亡率。蛋白酪氨酸磷酸酶Shp2(Src homology phosphotyrosyl phosphatase 2)由PTPN11基因编码，广泛地表达于机体各种组织和细胞中，其含有2个SH2结构区域，分别为N-SH2、C-SH2，及一个PTP结构区域，其作为细胞因子、生长因子及其他胞外刺激因素的下游信号分子，参与细胞增殖、分化、迁移等诸多细胞重要的生命活动。研究表明，Shp2的编码基因PTPN11存在大量与人类疾病相关的遗传多态性与突变位点，作为重要的节点分子，Shp2在血液系统恶性肿瘤如白血病及实体肿瘤如乳腺癌、肺癌、胃癌、肝癌等的发生发展过程中发挥着重要的调控作用，是其肿瘤治疗的潜在分子靶点。目前国内外关于Shp2在口腔鳞癌中的表达及作用的研究鲜见报道。因此，本实验从临床标本、体外细胞和分子机制三个层面研究Shp2在口腔鳞癌中的表达及对其生物学行为的影响。首先通过临床病例标本检测口腔鳞癌组织及癌旁组织中Shp2的表达差异，并进一步分析其表达水平与患者的临床资料之间的关系，探讨Shp2在口腔鳞癌中的临床意义。其次，应用RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术，构建Shp2慢病毒干扰载体，抑制舌鳞状细胞癌细胞SCC-4的Shp2基因表达，探讨Shp2基因沉默后对SCC-4细胞增殖、凋亡及侵袭能力的作用。同时研究Shp2基因沉默后对细胞凋亡相关蛋白的影响，初步阐明Shp2在口腔鳞癌细胞凋亡发生中的分子机制。本研究将为口腔鳞癌临床诊断、预后及治疗的新靶点提供新的思路和理论基础。
　　方法:
　　1.收集临床口腔鳞癌组织蜡块及临床有关资料，采用免疫组织化学染色方法观察Shp2蛋白在口腔鳞癌组织中的表达，并对免疫组化结果进行评分，评估Shp2的表达与患者的年龄、性别、烟酒暴露、肿瘤部位、肿瘤大小、临床分期、淋巴转移及病理分级等的相关性。
　　2.收集18例临床手术中新鲜的口腔鳞癌及相应的癌旁正常组织，采用Western Blot方法，进一步验证Shp2蛋白在口腔鳞癌组织及癌旁正常组织中的表达差异。
　　3.于Shp2PTPN11基因编码区选择4个siRNA靶点合成4对shRNA干扰序列，分别与慢病毒载体连接，构建Shp2基因RNA干扰慢病毒载体，筛选出最佳干扰组，显微镜下观察Shp2慢病毒干扰载体感染目的细胞人舌鳞状细胞癌细胞SCC-4的效率。应用Real Time PCR及Western blot检测其干扰效率，筛选出最佳干扰组，建立稳定抑制Shp2基因表达的SCC-4细胞株，为探讨Shp2在口腔鳞癌发生中的作用提供细胞模型。
　　4.采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法观察Shp2基因沉默后对SCC-4细胞24h、48h、72h及96h增殖率的影响。
　　5.应用流式细胞技术（AnnexinⅤ-APC/7-ADD染色法）及Westen Blot方法研究Shp2基因沉默后对SCC-4细胞凋亡的影响及其凋亡相关蛋白p53、Bax及Bel-2的变化。
　　6.采用Transwell小室侵袭实验，通过苏木精染色和细胞计数观察Shp2基因沉默后对SCC-4细胞体外侵袭能力的影响。
　　结果:
　　1.免疫组化结果发现，在口腔正常黏膜组织中，Shp2表达阴性或者呈弱表达，而在口腔鳞癌临床样本中高表达;进一步临床资料统计分析表明，在口腔鳞癌中Shp2蛋白的表达与患者的性别、年龄、是否吸烟、饮酒无关，与肿瘤的发生部位和体积大小亦无关。然而，临床分期在Ⅲ/Ⅳ期的肿瘤Shp2的表达较Ⅰ/Ⅱ期的强，在有淋巴转移的病例中，Shp2的表达显著增加，统计学上均有显著性差异(p＜0.05)。
　　2.临床新鲜口腔鳞癌组织进一步证明，除一例以外，Shp2在口腔鳞癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织中的表达(p＜0.05)，进一步验证了免疫组化结果。
　　3.Real-time PCR和Western blot检测结果显示Shp2-shRNA3干扰效率最佳，SCC-4细胞中Shp2基因及蛋白表达明显降低，应用RNAi设计的慢病毒干扰载体具有较好的干扰效果。
　　4.MTT法测定发现，Shp2基因沉默后，96h内SCC-4细胞的生长明显慢于对照组，出现明显的增殖抑制。
　　5.采用Annexin-Ⅴ-APC/7-ADD双荧光标记，流式细胞仪检测细胞凋亡发现，转染Shp2慢病毒干扰载体72h后的SCC-4细胞中，细胞凋亡率明显增加，同对照组正常细胞相比，差异具有显著性(p＜0.05)。Western Blot结果显示，凋亡相关通路蛋白p53、Bax表达增加，Bcl-2表达下降。
　　6.Transwell小室侵袭实验结果显示，转染Shp2慢病毒干扰载体72h后的SCC-4细胞的侵袭能力与对照组相比较明显下降，差异具有显著性(p＜0.05)。
　　结论:
　　Shp2在口腔鳞癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织，过表达的Shp2与口腔鳞癌的临床分期及淋巴转移密切相关;Shp2基因对口腔鳞癌细胞的生长起促进作用，同时可提高肿瘤细胞的侵袭能力;Shp2能抑制口腔鳞癌细胞凋亡，凋亡相关蛋白p53、Bax及bcl-2可能参与其凋亡调控机制。以上结果提示，Shp2与口腔鳞癌的进展和转移有关，在口腔鳞癌可能发挥重要的促癌基因作用，是口腔鳞癌淋巴结转移的危险因子，可作为口腔鳞癌临床诊断、判断预后、诊疗方案制定及肿瘤靶向治疗的潜在生物标记物和分子指标。