HDGF在阴茎鳞状细胞癌中的表达及意义HIF1A多态性与泌尿系统肿瘤的关系

背景：
　　阴茎鳞状细胞癌(Penile squamous cellcar cinoma，PSCC)占阴茎癌的绝大多数，常见于40～60岁有包皮过长或者包茎的患者，其确切病因和机制尚不完全明确。肝癌衍生生长因子(Hepatoma derived growth factor,HDGF)已被证实可作为多种类型恶性肿瘤发生、进展、预后的可靠指标，但其在PSCC中的作用仍然未有相关的研究报道。
　　目的：
　　本研究中，我们通过免疫组织化学(Immuno histo chemistry,IHC)的方法检测PSCC组织中HDGF、血管内皮生长因子-A(Vascular endothelial growth factor-A，VEGF-A)和Ki-67的表达，研究HDGF、VEGF-A、Ki-67表达与PSCC临床病理特征之间的关系，分析HDGF表达与VEGF-A和Ki-67表达之间的关系，探讨HDGF以及VEGF-A和Ki-67表达在PSCC进展过程中的意义。
　　方法：
　　2004年6月至2011年2月期间，54例PSCC患者在山东大学齐鲁医院泌尿外科接受手术治疗，术后经福尔马林固定、石蜡包埋的PSCC组织标本被纳入本次回顾性研究。对于每个PSCC石蜡标本做三个连续的厚度为4μm的组织切片，由非生物素聚合辣根过氧化物酶(Horse radish peroxidase，HRP)免疫组织化学方法检测HDGF、VEGF-A和Ki-67的表达。PSCC组织切片经过一系列二甲苯槽脱蜡，然后通过一系列浓度梯度的酒精槽水化。此后，在微波炉中加热15分钟(Minute，min)，以10mM柠檬酸盐缓冲液(pH=6.0)进行抗原修复。进而由含甲醇稀释的3.0％过氧化氢阻断内源性过氧化物酶活性，持续15min。用10％山羊血清孵育并阻断组织切片中非特异性抗原位点。随后，在4℃条件下用稀释的一抗孵育PSCC组织切片过夜，HDGF抗体应用的稀释比例为1∶100，VEGF-A抗体应用的稀释比例为1∶100和Ki-67抗体应用的稀释比例为1∶100。一抗的检测由二抗试剂盒和DAB试剂盒完成。最后PSCC组织切片用苏木精复染，盐酸酒精分化，梯度浓度的乙醇脱水，并用甘油明胶和一个盖玻片封片。为了进一步评估HDGF、VEGF-A和Ki-67的表达，每一个组织切片随机选取超过五个独立的放大倍数400倍的视野。在不了解PSCC临床病理资料的情况下完成PSCC组织切片HDGF、VEGF-A和Ki-67表达的免疫组织化学染色的评估。如以往报道所述HDGF和Ki-67的表达主要在细胞核区域，而VEGF-A主要积累在细胞质区域，并采用既往文献报道的方法进行评估。记录每个放大倍数400倍的视野中HDGF、VEGF-A、Ki-67表达阳性细胞的比例（阳性细胞数/该总细胞），计算每个组织切片中HDGF、VEGF-A、Ki-67表达阳性细胞的比例，进一步分析HDGF的表达与VEGF-A、Ki-67表达之间的关系。此外分析HDGF、VEGF-A、Ki-67表达与PSCC的临床病理特征和疾病预后的相关性。统计学分析由SPSS16.0统计软件(The Statistical Package for Social Sciencesversion16.0，SPSS16.0)完成。应用Pearson卡方检验比较HDGF、VEGF-A、Ki-67表达与PSCC临床病理特征、PSCC患者预后的关系。将HDGF表达和病程长短转化为分类变量后，构建Logistic回归模型进一步评估其作为预后指标的意义。双尾P＜0.05被认为具有统计学意义。
　　结果：
　　免疫组织化学染色结果显示HDGF和Ki-67主要表达在细胞核，VEGF-A主要累积在细胞质中。HDGF、VEGF-A、Ki-67的表达，大于中位数被分类为高表达，而小于中位数的HDGF、VEGF-A、Ki-67表达被分类为低表达。PSCC组织切片HDGF表达免疫组织化学结果显示，28例(51.9％)PSCC患者高表达HDGF，26例(48.1％)PSCC患者低表达HDGF。而后，统计HDGF的表达与PSCC临床病理特征的关系。HDGF的表达与年龄(P=0.284)、病程长短(P=0.180)、肿瘤直径(P=0.984)、PSCC细胞类型(P=0.645)、肿瘤细胞分级(P=0.884)、淋巴结受累情况(P=0.513)和吸烟情况(P=0.150)无明显的相关性。PSCC组织切片VEGF-A表达免疫组织化学结果显示，29例(53.7％)PSCC患者高表达VEGF-A，25例(46.3％)PSCC患者低表达VEGF-A。而后，统计VEGF-A的表达与PSCC临床病理特征的关系。VEGF-A的表达与PSCC细胞类型有统计学差异(P=0.030)，但是VEGF-A的表达与年龄(P=0.184)、病程长短(P=0.951)、肿瘤直径(P=0.816)、肿瘤细胞分级(P=0.109)、淋巴结受累情况(P=0.492)和吸烟情况(P=0.991)无明显的相关性。PSCC组织切片Ki-67表达免疫组织化学结果显示，26例(48.1％)PSCC患者高表达Ki-67，28例(51.9％)PSCC患者低表达Ki-67。而后，统计Ki-67的表达与PSCC临床病理特征的关系。Ki-67的表达与PSCC细胞类型有统计学差异(P=0.020)。但是Ki-67的表达与年龄(P=0.266)、病程长短(P=0.761)、肿瘤直径(P=0.984)、肿瘤细胞分级(P=0.145)、淋巴结受累情况(P=0.627)和吸烟情况(P=0.422)无明显的相关性。28例高表达HDGF的PSCC患者中，19例(67.9％)PSCC患者高表达VEGF-A，9例(32.1％)PSCC患者低表达VEGF-A;26例低表达HDGF的PSCC患者中，10例(38.5％)PSCC患者高表达VEGF-A，16例(61.5％)PSCC患者低表达VEGF-A。PSCC中，HDGF表达与VEGF-A表达密切相关(P=0.030)。28例高表达HDGF的PSCC患者中，11例(39.3％)PSCC患者高表达Ki-67，17例(60.7％)PSCC患者低表达Ki-67;26例低表达HDGF的PSCC患者中，15例(57.7％)PSCC患者高表达Ki-67，11例(42.3％)PSCC患者低表达Ki-67。PSCC中，HDGF表达与Ki-67表达无密切相关性(P=0.176)。首先，我们探讨年龄、肿瘤大小、肿瘤细胞分级、淋巴结受累情况、吸烟状况、病程长短、HDGF表达、VEGF-A表达和Ki-67表达等临床病理特征与PSCC患者的生存率之间的关联。结果发现病程大于六个月的患者的存活率比病程小于六个月的患者的存活率低(43.3％vs70.8％，P=0.043)。HDGF高表达较HDGF低表达的患者也显示出较差的生存率(39.3％vs73.1％，P=0.013)。其余的临床病理特征，如年龄(P=0.542)、肿瘤大小(P=0.625)、肿瘤细胞分级(P=0.826)、淋巴结受累情况(P=0.750)、肿瘤细胞类型(P=0.445)、吸烟状况(P=0.434)、VEGF-A(P=0.542)和Ki-67(P=0.761)的表达，与PSCC患者生存率无显著相关性。为了进一步评估和确定与PSCC生存率密切相关的临床病理特征，我们建立Logistic回归方程筛选潜在的独立预后因素。HDGF表达和PSCC病程两个与预后显著相关的因素被纳入Logistic回归。结果证实，HDGF高表达是预测PSCC患者预后的一个独立的指标(P=0.028)。
　　结论：
　　1.HDGF的异常表达与PSCC的预后密切相关(P＜0.05)。HDGF将作为一个可靠的、有应用前景的评估PSCC预后的指标和靶向治疗靶点。
　　2.VEGF-A的表达与PSCC的细胞类型相关(P＜0.05)，但与PSCC预后无显著的相关性。HDGF可调节PSCCVEGF-A的表达。
　　3.Ki-67的表达与PSCC的细胞类型相关(P＜0.05)，但与PSCC预后无明显的相关性。PSCC中，HDGF表达与Ki-67的表达无相关性。
　　4.PSCC的病程可能为PSCC预后的一个指标。