乙型肝炎病毒感染转归及疫苗免疫应答影响因素研究

前言：
　　乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是一个世界性的卫生问题，它能引起肝炎、肝硬化、甚至肝细胞癌，严重危害人类健康。我国是乙肝病毒感染大国，目前我国1-59岁人群乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)携带率为7.18％，据此推算，我国现有的慢性HBV感染者约为9300万人，其中慢性乙型肝炎患者约2000万。
　　不同个体感染HBV后，结局不尽相同。成年人感染HBV后约90％-95％的感染者可自发清除病毒而免受疾病侵袭。另外，约5％-10％的HBV感染者会转为慢性感染。影响HBV感染后临床转归的因素非常复杂，包括感染年龄、病毒基因型、宿主基因型等。近年来关于编码多种细胞因子如干扰素、白细胞介素和肿瘤坏死因子等的基因多态性与HBV感染结局的相关性研究成为热点并且已经得到证实。随着分子生物学技术和基因组学的发展，已经发现了一大批与HBV感染相关的基因，并且部分HBV感染相关的基因已经得到精确的定位和功能研究。这些研究均提示，个体间某些细胞因子、蛋白质分子的单核苷酸多态性(single nucleotidepolymorphism，SNP)可能是导致机体免疫功能状态差异的重要因素，并最终影响着HBV感染的不同临床转归。
　　近年来，越来越多的研究显示固有免疫分子和固有免疫应答在抗病毒感染中发挥重要作用，其中三基序(tripartite motif, TRIM)蛋白家族是当前抗病毒固有免疫中的研究热点之一。TRIM22分子新近被证实具有抑制乙肝病毒的作用而受到关注。对于乙肝病毒感染者而言，一旦激发体内的TRIM22分子，携带者便可诱发相应免疫应答，抑制病毒复制，清除体内的乙肝病毒，这就说明了在一定程度上TRIM22分子起到了控制乙肝病毒“开关”的作用。关于TRIM22基因SNP是否影响了机体对HBV的免疫应答，从而导致HBV感染的不同临床转归，目前尚未见相关报道。
　　乙肝疫苗接种是预防HBV感染的有效措施，我国目前对新生儿实行乙肝疫苗免疫接种，已使5岁以下儿童的HBsAg携带率降至0.96％。然而，未免疫人群及高危人群仍然处于乙肝病毒感染的威胁中。另外，尽管接受标准的乙肝疫苗免疫接种，仍有4％-10％的健康受试者不能产生足够的保护性抗体。如何对这些人群采取有效措施预防HBV感染仍是面临的重要任务。
　　锌作为一种必须的微量元素，参与包括信号转导、转录和复制等许多病理生理过程，在免疫系统的发育及免疫功能的维持中发挥重要作用。2003年，WHO就将锌缺乏认定为引发疾病的首要危险因素之一。有数据显示9.5％的美国人和33.1％的东南亚人存在锌摄入量不足，尤其在妊娠期，由于对锌的需求量剧增，孕妇和胎儿更容易出现锌缺乏。而锌缺乏是造成哺乳动物免疫功能缺陷最常见的原因之一，妊娠期锌缺乏不仅影响母体的免疫功能，而且导致新生儿免疫功能缺陷。锌缺乏可以降低流感疫苗、霍乱疫苗等多种疫苗的免疫接种效力。然而，目前还没有关于妊娠期锌缺乏对子代接种乙肝疫苗免疫应答影响的相关研究报道。
　　本研究从机体对HBV免疫应答的角度，探讨了TRIM22单核苷酸基因多态性与HBV感染不同临床转归的关系，为阐明HBV感染者不同临床转归的免疫遗传机制提供科学依据，对感染者的预后判断及HBV的防治策略提供科学依据;同时从机体对疫苗免疫应答的角度对妊娠期锌缺乏与仔鼠乙肝疫苗免疫效力之间的关系和机制进行研究，可以为明确乙肝疫苗免疫后无应答或弱应答的机制，探讨妊娠期预防性补锌策略的可行性，以期改善和提高乙肝疫苗接种效果提供理论及实验依据。
　　实验方法：
　　以293例慢性乙型肝炎患者、224例HBsAg携带者和248例自限性HBV感染者为研究对象，应用血生物化学方法检测ALT、AST、TBiL、ALB、PTA、CHE水平，应用HBV核酸定量检测试剂盒检测HBVDNA水平，从各组受试对象外周血单个核细胞中提取基因组DNA，针对TRIM22编码基因目的区域RING区和SPRY区设计引物并进行PCR扩增，扩增产物在ABI3700型DNA自动化测序仪上进行测序分析，计算基因型频率及等位基因频率，应用SAS统计分析软件包进行统计学分析。
　　以饲喂不同含锌量饲料的BALB/c孕鼠子代作为研究对象，仔鼠出生后24小时内及第2周和第4周末进行乙肝疫苗全程免疫接种。末次接种两周后处死仔鼠，取血液标本，应用电感耦合等离子体质谱仪检测锌含量，应用ELISA法检测HBsAg特异性抗体及其亚型。制备脾淋巴细胞，检测HBsAg特异性增殖应答。流式细胞仪检测细胞表面分子确定淋巴细胞分类及数量，检测细胞内因子IFN-γ和IL-4与CD4+和CD8+T细胞的共表达水平，应用ELISA法检测脾单细胞悬液培养上清中IFN-γ和IL-4浓度。
　　实验结果：
　　一、TRIM22基因RING区及SPRY区单核苷酸基因多态性检测
　　1、研究对象的人口学特征及环境危险因素分布
　　慢性肝炎组的年龄及饮酒者的比例显著高于HBsAg携带组;两组在性别、吸烟方面无显著差异。慢性肝炎组与自限性感染组在年龄、吸烟和饮酒方面无显著差异;慢性肝炎组男性患者的比例显著高于自限性感染组。
　　2、TRIM22基因RING区及SPRY区测序结果
　　对TRIM22编码基因RING区及SPRY区测序后共检测到3处SNP位点，分别为RING区-336G/A;RING区-364T/C位点和SPRY区-7C/T。RING区-364T/C位点检测到TT、TC、CC三种基因型，-336G/A位点检测到GG及GA两种基因型，-7C/T位点检测到CC及CT两种基因型。
　　二、TRIM22基因RING区及SPRY区的SNP与HBV感染临床转归的相关性研究
　　1、慢性感染者基因型与HBVDNA载量相关
　　将慢性肝炎组与HBsAg携带组合并进行分析发现，在HBV慢性感染者中，-364T/C位点CC基因型的病毒载量高于TC+CC基因型者。
　　2、慢性肝炎组基因型与转氨酶水平相关性
　　慢性肝炎组中，-364T/C位点CC基因型的患者ALT、AST水平低于TC+TT基因型患者。
　　3、TRIM22基因RING区基因型与等位基因的频率分布
　　慢性肝炎组与HBsAg携带组TRIM22基因RING区SNP位点-364T/C的基因型与等位基因频率无显著差异。慢性肝炎组-364CC基因型频率显著高于自限感染组，慢性肝炎组-364C等位基因频率显著高于自限感染组。
　　4、TRIM22基因RING区SNP与HBV感染结局相关性的Logistic回归分析
　　以自限性HBV感染者为对照组对影响乙肝慢性化的宿主遗传因素进行多因素Logistic回归分析，调整掉年龄、性别、吸烟、饮酒因素的影响后，-364T/C位点CC基因型是HBV感染慢性化的独立危险因素。
　　三、妊娠期锌缺乏对仔鼠体液免疫及细胞免疫应答的影响
　　1、妊娠期锌缺乏抑制免疫细胞向脾脏聚集
　　接种乙肝疫苗后对照组仔鼠脾细胞数显著增多，而ZD组和ZS组脾细胞数量与未接种疫苗的仔鼠相比无显著差异。
　　2、妊娠期锌缺乏对小鼠脾脏T细胞数量和细胞免疫应答的影响
　　与对照组相比，ZD组仔鼠脾T细胞的绝对数量显著降低，但T细胞在全脾细胞中比例却升高，ZD仔鼠脾的CD4+T细胞在脾T细胞中的比例显著降低，而CD8+T细胞的比例却有明显的升高，CD4+/CD8+比值降低。
　　3组仔鼠脾细胞经rHBsAg刺激72 h后，ZD和ZS组均未发生明显的增殖。
　　3、妊娠期锌缺乏对小鼠脾脏B细胞数量和体液免疫应答的影响
　　与对照组相比，ZD组仔鼠脾CD19+B细胞不仅绝对数量显著降低，而且在全脾细胞中的比例也显著降低。ZS组仔鼠的妊娠晚期补锌治疗对B细胞数量及在全脾细胞中的比例并无改善作用。
　　ELISA法检测发现，ZD组仔鼠的总IgG水平以及IgG2a和IgG1水平均显著低于对照组，并且IgG2a/IgG1比值也显著降低。
　　四、妊娠期锌缺乏影响仔鼠体液免疫及细胞免疫应答的机制
　　1、妊娠期锌缺乏对Th1和Th2类细胞因子释放的影响
　　ELISA法对3组仔鼠脾细胞分泌IFN-γ和IL-4的水平进行检测，发现与ZD和ZS组仔鼠脾细胞分泌的IFN-γ显著降低，而3组间IL-4水平无统计学差异。
　　2、妊娠期锌缺乏对脾CD4+T细胞IFN-γ和IL-4表达的影响
　　3组仔鼠脾细胞悬液经rHBsAg刺激72 h，流式细胞仪检测发现，ZD组仔鼠HBsAg特异性CD4+T细胞中IFN-γ表达的水平最低，ZS组仔鼠与ZD组相比并无显著差异。3组动物IL-4表达水平无统计学差异。
　　3、妊娠期锌缺乏对脾CD8+T细胞IFN-γ表达的影响
　　与对照组比较后发现，ZD组仔鼠表达IFN-γ的HBsAg特异性CD8+T细胞明显减少，而ZS组仔鼠与ZD组相比并无明显变化。
　　结论：
　　1.辽宁省汉族HBV感染者TRIM22蛋白RING区及SPRY区编码基因SNP主要发生在-364T/C位点。
　　2.TRIM22蛋白RING区编码基因-364T/C位点SNP与HBV感染临床转归相关， CC基因型是HBV感染慢性化独立危险因素。
　　3.妊娠期锌缺乏仔鼠接种乙肝疫苗后体液免疫和细胞免疫水平均降低。
　　4.妊娠期锌缺乏抑制Th1细胞免疫反应，导致Th1/Th2细胞因子网络平衡失调，影响B淋巴细胞活化、增殖并分化为浆细胞，导致抗体合成和分泌减少，最终影响乙肝疫苗的免疫效果。