酵母表达鲑鱼降钙素基因载体的构建及相关研究

十九世纪六十年代，降钙素作为一种降血钙的物质被copp发现。它在哺乳动物中起源于甲状腺C细胞，在鱼类中后腮体分泌。降钙素是一种32个氨基酸组成的多肽内激素，其蛋白结构的N端为二硫键，C端为脯胺酰胺基团。降钙素在体内的钙、磷代谢中发挥着重要的作用。它能够直接作用于破骨细胞，降低破骨细胞的活性，从而抑制骨的吸收。降钙素的这种抗骨吸收活性使降钙素能够被广泛的使用于治疗Paget综合症，骨质疏松，以及高钙血症。在所有的降钙素当中，鲑鱼降钙素的活性最高，大约是人体的30—40倍。临床上已经多年使用鲑鱼降钙素进行治疗。然而，一方面，鲑鱼降钙素的现有给药途径仅仅注射和鼻喷两种，病人的依从性差。另一方面，鲑鱼降钙素的价格昂贵也限制了它在我国的普及。如何实现鲑鱼降钙素的口服途径，降低鲑鱼降钙素的造价成为了当前研究的重点。 为了达到上述目标，本文通过生物工程的方法构建了含肠激酶位点的转鲑鱼降钙素基因的酵母yAGA2一sCT，并通过细胞实验和动物实验进行了活性检测。首先，通过化学与酶法相结合，人工合成了由酿酒酵母偏爱密码子组成的鲑鱼降钙素基因。合成的产物通过电泳进行了验证。合成的鲑鱼降钙素基因被克隆到pucl8载体上进行保存。蛋白结构分析显示该基因和天然鲑鱼降钙素的蛋白结构相同。然后，该基因被克隆到了穿梭载体p—sf上得到了质粒p—sct—sf。质粒p—sf由INVITROGEN公司的质粒pydl改造而来。酵母URA3基因分别被加到了质粒pydl表达框的两侧当作重组位点，以增加酵母转化子的稳定性。经过改造以后的质粒和原质粒一样表达配体蛋白AGA2亚基。AGA2亚基与酵母表面的AGA1亚基通过二硫键连接于酵母表面的葡聚糖上，从而实现了外源蛋白在酵母表面的表达。质粒p-set-sf通过LiAc转化的方法转化酵母菌株EBY100,得到了转基因酵母yAGA2-sCT。同时质粒p-sf转化酵母EBY100,得到了转化子yAGA2-V5。在后继实验当中，yA6A2-V5作为对照验证重组鲑鱼降钙素的活性。利用间接荧光标记的方法，在荧光显微镜下观察到了转化子yAGA2-V5和yAGA2-sCT外源蛋白的表达。进一步的流式细胞仪分析显示，表达开始12小时之后，yAGA2-sCT中有65％的细胞表达外源蛋白，yAGA2-V5转化子中有52％的细胞表达外源蛋白。在肠激酶的作用下，转基因酵母中的外源蛋白释放到酶切液的上清当中。该上清简称为EKS。外源表达的蛋白通过细胞实验对其体外的活性进行了检测。实验中采用的是破骨细胞。破骨细胞作为一种终分化细胞，能够在骨组织上进行骨的吸收，形成骨陷窝。实验首先通过骨片切割机制作了小牛皮质骨骨片。骨片与破骨细胞进行培养的过程中加入了yAGA2-V5 EKS和yAGA2-sCI EKS。密钙息(医用鲑鱼降钙素注射液)作为培养实验的阳性对照。骨片培养一周之后，骨片在数码显微镜下拍照并计算出骨陷窝面积。结果发现yAGA2-sCT EKS能够显著减少骨陷窝的生成。即重组鲑鱼降钙素能够在体外抑制破骨细胞的活性。 根据英国药典的方法进行了动物降血钙实验。动物采用了正常的Wistar雌性大鼠。实验分为阴性对照组，阳性对照组和试剂组。阴性对照组灌胃5g/kg yAGA2-V5，阳性对照组则注射200mIU/kg密钙息(医用鲑鱼降钙素注射液)。试剂组当中，灌胃了低、中、高三个剂量(0.1 g/kg，0.5 g/kg，5 g/kg)冷冻干燥的yAGA2-sCT。实验动物在不同的时间段(1，2，4，6，8，10小时)从眼球丛静脉毛细血管吸取全血制备血清，血清送往青岛市解放军401医院测定血钙值。实验结果表明，灌胃5 g/kg冷冻干燥的酵母yAGA2.sCT显著降低了大鼠血钙值(p