Wnt/β-catenin信号通路及B10细胞对矽肺Th免疫调控机制的研究

目的：
　　本研究利用小鼠矽肺模型，通过气管灌注β-catenin短发夹RNA(short hairpinRNA，shRNA)慢病毒载体悬液阻断肺部的Wnt/β-catenin信号通路或者腹腔注射抗小鼠CD22单克隆抗体消除B10细胞，动态观察矽肺进展过程中不同Th细胞亚群的数量及其相关细胞因子的变化，进而阐明矽肺发病过程中Wnt/β-catenin信号通路和B10细胞对Th免疫的调控作用，为探索矽肺的发病机制提供新的理论依据。
　　方法：
　　一、建立Wnt/β-catenin信号通路阻断模型和B10消除模型
　　C57BL/6小鼠（6-8周，雌性）按体重随机分组。非暴露式气管内灌注3×107TUβ-catenin shRNA慢病毒悬液，干扰小鼠肺部的β-catenin表达，建立Wnt/β-catenin信号通路阻断模型，使用相同滴度的对照慢病毒建立对照模型;通过腹腔注射300μg anti-CD22 mA特异性消除小鼠体内B10细胞，建立B10消除模型，并使用等体积IgG1同型抗体作为对照。对照组和模型组小鼠分别进行非暴露式气管内灌注相同体积的生理盐水和二氧化硅颗粒悬液。将各组小鼠分别于灌注后7、28、56天后处死，收集肺组织、脾组织、肺门淋巴结(hilar lymph node，HLN)、肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)，经过相应的处理后进行实验测定。
　　二、炎性细胞分类计数
　　将收集的肺泡灌沈液通过3000 rpm低温离心10 min，获取细胞并重悬于1 ml磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution，PBS)制备单细胞悬液，取10μl细胞悬液置于细胞计数板上，进行细胞计数。细胞浓度=（四个大格的细胞总数/4）×104。取400μl细胞悬液，低温3000 rpm离心10 min，弃上清，加入20μl小牛血清混匀，吸取5μl推片，室温晾干后甲醇固定，待甲醇晾干后使用Wright-Giemsa染液进行双染，室温染色10 min后蒸馏水冲洗玻片背面。显微镜下计数200个细胞中淋巴细胞，中性粒细胞，巨噬细胞的数量。
　　三、病理切片染色
　　肺组织常规石蜡切片(5μm)进行苏木素伊红(Hematoxyln&Eosin，H&E)染色。烤片:石蜡切片放入烘箱内60℃烘烤2h。脱蜡:将切片在二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中各浸泡10 min。脱二甲苯:梯度酒精由高浓度至低浓度浸泡各5 min，最后用流水冲洗。细胞核染色:苏木素染液浸染10 min，流水冲洗。分化:2％盐酸酒精浸泡20 s至1 min，流水冲洗。返蓝:自来水浸泡2h。细胞浆染色:0.5％伊红染液浸染1至2 min，流水冲洗。脱水:梯度酒精由低浓度至高浓度浸泡各5 min。透明:二甲苯Ⅱ浸泡10 min，换到二甲苯Ⅰ再浸泡10 min。封片:从二甲苯中取出后马上滴加中性树胶并使用盖玻片封片。
　　肺组织常规石蜡切片（5μm）进行Masson染色。烤片:石蜡切片放入烘箱内60℃烘烤2h。脱蜡:将切片在二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中各浸泡10 min。脱二甲苯:梯度酒精由高浓度至低浓度浸泡各5 min，最后用流水冲洗。细胞核染色:苏木素染液浸染10 min，流水冲洗。分化:2％盐酸酒精浸泡20 s至1 min，流水冲洗。肌纤维染色:丽春红酸性复红溶液浸染5 min，0.2％冰醋酸浸洗片刻。分化:1％磷钼酸溶液浸染5 min。胶原纤维染色:苯胺蓝染液浸染5 min，0.2％冰醋酸浸洗片刻。脱水:梯度酒精由低浓度至高浓度浸泡各5 min。透明:二甲苯Ⅱ浸泡10 min，换到二甲苯Ⅰ再浸泡10 min。封片:从二甲苯中取出后马上滴加中性树胶并使用盖玻片封片。
　　四、流式细胞术
　　取脾、肺门淋巴结细胞各1×106加入1 ml含有胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的1640培养基中，加入2μl刺激剂37℃培养5h后收集细胞，staining buffer清洗两次，表面染色;staining buffer清洗两次，固定-破膜液孵育细胞;固定-破膜缓冲液清洗细胞两次，细胞内染色;staining buffer清洗两次，加入300μl1％多聚甲醛重悬细胞，FACSCantoⅡ流式细胞仪检测，Diva软件进行分析。
　　结果：
　　一、阻断Wnt/β-catenin信号通路加重矽肺炎症并减轻纤维化
　　使用慢病毒阻断Wnt/β-catenin通路后，二氧化硅颗粒诱导的矽肺炎症明显加重。早期时间点慢病毒处理组小鼠表现出严重的细胞浸润，同时炎性细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6大量分泌，显著高于模型组与对照病毒组;随着疾病进展，模型组与对照病毒组的炎症逐渐消退，浸润的炎性细胞减少，肺泡壁发生增厚并出现细胞性结节，而慢病毒处理组在28、56天依然处于炎症阶段，可见明显的炎性细胞浸润。同时，由于炎症持续存在，纤维化的发生受到了抑制，56天时慢病毒处理组的胶原沉积明显较轻。
　　二、阻断Wnt/β-catenin-号通路可以促进Th17反应
　　早期炎症阶段，慢病毒处理组小鼠Th17反应显著增强。通过对Th17细胞进行分析，结果显示早期炎症阶段CD4+T细胞中Th17细胞比例显著增加，其特异性细胞因子Il17a、Il21 mRNA表达水平也有显著增高。调控Th17分化增殖的细胞因子中，Il6 mRNA在7天时间点的大量表达是Th17细胞增多的主要原因，而Il23在三个时间点的表达与模型组、对照病毒组相比没有差异。
　　三、阻断Wnt/β-catenin信号通路延缓Th1向Th2极化的过程
　　阻断wnt信号通路后，Th1反应增强，其中Th1细胞占CD4+T细胞的比例在7天、56天都显著高于模型组和对照病毒组，Th1特异性细胞因子Ifng mRNA在7天也有明显升高。Th2细胞的特异性核转录因子Gata3及其表达的促纤维化因子Il4、Il13 mRNA在56天均明显低于模型组和对照病毒组。因此，在矽肺的疾病进展过程中，晚期纤维化阶段慢病毒处理组Th2反应受到抑制，同时Th1反应仍处于较高水平，使Th1向Th2极化的过程发生延缓，最终导致纤维化程度减轻。
　　四、阻断Wnt/β-catenin信号通路通过抑制Tregs调控Th免疫反应
　　流式细胞术结果显示，慢病毒处理组Tregs在7天显著减少，通过RealtimeRT-PCR检测Tregs特异性核转录因子显示，Foxp3 mRNA在7天同样显著减少，与Tregs的趋势相一致。同时，Tregs表达的抑制性细胞因子Tgfb和Il10 mRNA在7、56天均低于模型组和对照病毒组。因此，阻断Wnt信号通路可以抑制Tregs及其所分泌的细胞因子，引起Tregs介导的免疫抑制能力降低。
　　五、B10细胞参与调控矽肺炎症纤维化
　　对小鼠进行气管内灌注二氧化硅悬液后，应用流式细胞术检测小鼠肺门淋巴结内及脾组织内B10细胞的含量，结果显示模型组小鼠在7、28、56三个时间点的B10细胞均显著高于对照组。提示B10细胞参与调控矽肺的炎症和纤维化。此外，腹腔注射anti-CD22单克隆抗体后，灌注了二氧化硅的小鼠肺门淋巴结和脾组织内的B10细胞含量较模型组显著减少，证明anti-CD22单克隆抗体可以有效消除小鼠体内的B10细胞。
　　六、消除B10细胞加重矽肺的炎症并减轻纤维化
　　病理结果显示，矽肺小鼠在消除B10细胞后，早期的矽肺炎症相相较于模型组明显加重，肺泡渗出液及炎性细胞聚集增多。此外，7天时间点B10细胞消除组小鼠的肺泡灌洗液中细胞总数以及炎性细胞因子TNF-α、IL-6也显著高于模型组，其中细胞分类计数结果证明B10细胞消除可以诱导淋巴细胞的大量聚集。28天时肺部炎症逐渐减轻，模型组开始出现小的细胞结节和肺泡壁增厚，而B10细胞消除的矽肺小鼠未出现细胞结节，仍处于炎症阶段。56天时小鼠的矽肺炎症基本消失，模型组小鼠出现较大的细胞性结节，B10细胞消除组可见小的细胞结节，肺泡壁增厚相对较轻。Masson染色显示B10细胞消除组小鼠肺部胶原沉积相对较轻，同时经Realtime PCR测定，促纤维化细胞因子TGF-β mRNA表达量在28、56天均显著低于模型组。
　　结论：
　　1、阻断Wnt/β-catenin信号通路会加重矽肺的炎症并延缓纤维化的发生发展。
　　2、Wnt/β-catenin信号通路可以通过调节Tregs影响矽肺的Th免疫应答。
　　3、消除B10细胞会加重矽肺的炎症并减轻纤维化。
　　4、Tregs介导了B10细胞对矽肺Th免疫应答的调控作用。