亲和层析法纯化磷酸激酶的研究

磷酸激酶(kinase)是一类催化以ATP为供体的磷酸基转移反应的酶，它们在药物生产、临床应用以及抗癌药物的研究等方面都具有重要的意义。本文开展了采用亲和层析方法对己糖激酶(HK，EC2.7.1.1)分离纯化工艺的研究，通过亲和层析剂制备工艺的确定和亲和柱层析法分离纯化工艺的优化，获到了一条较佳的磷酸激酶纯化工艺路线。结果表明，该磷酸激酶亲和层析剂的制备成本低，合成工艺简单，分离纯化工艺效果良好，克服了一般亲和层析剂制备过程中费时、有毒性等缺点，对制备大量高纯度的磷酸激酶具有良好的应用前景。 啤酒酵母经过预处理，冻融法破碎细胞后得到酶粗提液，经硫酸铵分步盐析(30％～70％)，酶粗提液中HK的比活提高了3.3倍，酶活回收率为70.9％。 通过对配基、接臂、载体、活化方法等方面的选择，确定了以纸纤维为载体、环氧氯丙烷为活化剂、1，6-己二胺为间隔臂、ATP为配基制备磷酸激酶亲和层析剂的工艺过程。在此基础上对主要工艺参数进行优化，确定了最佳反应条件为：活化剂用量1ml/(g载体)，接臂pH6.0，再活化pH6.0，偶联温度35℃，偶联初始ATP浓度4.0mmol/L，偶联pH6.0，偶联时间4h。在该条件下得到配基(ATP)密度为5.36μmol/(g载体)的亲和层析剂。 开展了采用自制亲和层析剂分离纯化啤酒酵母中的磷酸激酶工艺研究。首先考察了缓冲液的种类、pH、离子强度以及样品的蛋白浓度等对亲和层析剂吸附HK的影响，结果表明，Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液(0.05mol/L,pH7.0)体系最适合HK的亲和吸附，样品的蛋白浓度以5.80mg/ml附近为宜；然后确定了HK亲和柱层析的工艺条件：亲和层析剂装柱的径高比1∶20，洗脱液流速1.0ml/min，在此条件下，取酶粗提液上柱，经NaCl梯度(0.1～0.3mol/L)洗脱，HK的比活可提高18.5倍，达到236.24U/mg，纯化后的HK酶活回收率为30％左右，取盐析后的酶液上柱，纯化后的HK酶活回收率可提高至50％以上；在SDS-PAGE电泳中，纯化后的HK基本呈现一条带。