LPAR3、COX-2和VEGF蛋白在反复移植失败患者着床期子宫内膜表达的研究

背景及意义:
　　三十年来，体外受精一胚胎移植(invitrofertilizationandembryotransfer，IVF-ET)技术飞速发展。胚胎质量和子宫内膜容受性是助孕技术成功与否的两大关键因素。随着胚胎实验室技术的日趋完善和临床超促排卵方案的不断优化，胚胎质量得到很大提高。但胚胎移植成功率仍然徘徊在一个较低的水平。因此，子宫内膜容受性的问题日趋受到重视。子宫内膜容受性指子宫内膜在较短时期内对胚胎具有一个接受能力，这通常发生月经周期的第19～24天，称为“种植窗期”。有报道称超过半数的移植失败是由于子宫内膜容受性降低导致。多数学者认为，既往周期中移植次数超过3次或者移植优质胚胎总数大于10个仍未能成功妊娠，被称为胚胎反复移植失败(RIF)。目前，对RIF的研究主要集中在子宫内环境，卵巢分泌的甾体激素，自身免疫，输卵管因素以及心理因素等方面导致的子宫内膜容受性缺陷上，但是至今仍无法有效解决反复移植失败这一临床问题。反复移植失败给患者带来巨大的经济压力和精神压力。
　　子宫内膜容受性的建立是由一系列甾体激素、黏附蛋白、细胞因子协同作用的结果。近年来，有学者发现胚胎种植过程与肿瘤细胞侵袭转移极为相似。溶血磷脂酸(Lysophosphatidicacid，LPA)具有生长因子样作用，可以特异性结合靶器官上的受体，发挥多重生物学效应。在已知的6种受体中，LPAR3受体与雌性生殖最为密切相关，主要存在于女性卵巢、胎盘、子宫内膜等组织。有研究通过敲除雌性小鼠LPAR3基因，发现子宫内膜前列腺素、环氧合酶-2(Cyclooxygenase-2，COX-2)的表达均降低，同时出现胚胎种植延迟，在给予外源性前列腺环素类药物后，雌小鼠胚胎种植延迟得以改善，这提示LPAR3-COX2-PGS下游信号途径调节胚胎种植。国内亦有研究发现LPAR3在整个女性月经周期子宫内膜上均有表达。而与子宫内膜血管化关系最密切的调节因子血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)受COX-2合成的PGs调控。PGE2可以通过雌孕激素受体激活相关蛋白和转录因子，上调VEGF的表达。胚胎着床部位子宫内膜血管网的建立和子宫内膜蜕膜化的发生，是囊胚得以成功黏附的重要条件。那么反复移植失败患者着床期子宫内膜中LPAR3、COX-2和VEGF表达如何，是否与此类患者子宫内膜容受性受损有关，本课题将就这一问题进行初步研究。
　　本实验选取郑大一附院生殖中心反复移植失败患者为研究对象，通过研究其子宫内膜种植窗期LPAR3、COX-2、VEGF蛋白的表达和相关性，为研究子宫内膜容受性提供理论依据，以改善RIF患者临床妊娠率。
　　研究目的:
　　通过检测LPAR3、COX-2和VEGF在RIF患者种植窗期子宫内膜上的定位与表达，探索反复移植失败患者子宫内膜容受性受损的机制，为改善子宫内膜容受性提高胚胎种植率提供理论依据。
　　材料与方法:
　　选取2014年1月至2014年3月期间即将在郑州大学第一附属医院生殖中心接受IVF-ET/ICSI-ET/Thaw-ET助孕患者，选取有助孕妊娠史拟再次助孕者为对照组，选取3个及以上周期均有优质胚胎移植或移植大于等于10枚优质胚胎仍未妊娠者为实验组，纳入标准(1)基础内分泌正常(2)月经规律，28～35天(3)近3个月内未使用甾体激素(4)宫腔镜等辅助检查证实宫腔形态正常，无子宫畸形、内膜息肉等(5)无染色体疾病、无免疫性疾病、非传染病活动期等。符合纳入标准的患者均于月经第21～22天拟建病例日抽取血清孕酮值(P)，确定其处于黄体期后行内膜活检，内膜活检日空腹抽取血清雌二醇(E2)，并测量子宫内膜厚度。收集内膜后，部分标本投入95％酒精送常规病理，剩余标本分为两份，一份用于4％多聚甲醛固定，行免疫组化检测，一份用生理盐水冲洗后立即置入-80℃冰箱冷冻保存，行westernblot。数据分析采用SPSS15.0统计学软件。
　　结果:
　　1.免疫组化结果显示，LPAR3、COX-2及VEGF在两组种植窗期子宫内膜中均有表达，表达部位以子宫内膜腺上皮细胞为主，LPAR3、COX-2还在子宫内膜腔上皮及部分基质细胞中有表达，而VEGF则在部分表达在间质细胞和血管内皮细胞包浆中。三者的平均光密度值比较，RIF组显著低于对照组，有显著统计学差异(P＜0.01)。
　　2.Westernblot结果显示，两组内膜中均检测到LPAR3、COX-2和VEGF，但在RIF组的表达显著小于对照组，差异有显著统计学意义（LAR3:0.354±0.053VS0.279±0.041,P＜0.01;COX-2:0.571±0.087VS0.165±0.022,P＜0.01;VEGF:0.627±0.096VS0.313±0.045,P＜0.01)。
　　结论:
　　1.LPAR3在着床期子宫内膜上的表达部位和特点与反应子宫内膜容受性的VEGF一致，可作为潜在的预测子宫内膜容受性的标志物。
　　2.LPAR3、COX-2及VEGF在RIF患者着床期子宫内膜中表达均下降，提示RIF患者子宫内膜容受性降低，这可能是胚胎反复种植失败的原因。
　　3.RIF患者着床期子宫内膜LPAR3、COX-2及VEGF表达降低，提示LPAR3、COX-2和VEGF三者可能通过某种机制共同调节子宫内膜血管的生成从而参与胚胎的种植。