棘孢木霉和球毛壳菌免疫诱导蛋白及其功能研究

生物防治菌通过多种机制对植物病原菌进行抑制,近年研究发现有些生防菌能够诱导植物产生抗病性。目前国内外对生物防治菌与病原菌以及病原菌与植物之间的相互作用研究的较多,而对生防菌与植物间的相互作用研究的较少,丝状真菌的研究更是鲜有报道。为了研究生物防治相关基因,本实验室分别构建了棘孢木霉T4(Trichoderma asperellum T4)和球毛壳菌W7(Chaetomium globosum W7)菌丝体的cDNA文库。通过测序与生物信息学分析获得棘孢木霉T4和球毛壳菌W7的免疫诱导蛋白基因,分别命名为EplT4和EplW7。序列比对发现两个蛋白的序列一致性仅为65.22％,在结构和功能上可能存在差异,因此有必要分别对两基因进行研究。
　　对EplT4和EplW7的蛋白功能进行研究需要足量的蛋白,因此分别将EplT4和EplW7基因在毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中进行异源表达。为了方便后续蛋白检测及分离纯化,在重组蛋白的N端引入了酿酒酵母的信号肽α-factor,C端加入6个组氨酸标签。通过梯度浓度的G418抗生素进行筛选,并对转化子进行验证,分别获得毕赤酵母转化子Ppa-EplT4和Ppa-EplW7。为了进一步提高重组蛋白的产量,我们利用响应面分析法,对毕赤酵母产EplT4和EplW7的发酵条件进行了优化,使重组EplT4在毕赤酵母中的表达量达到37.70mg/L,重组EplW7的产量达到17.80mg/L。将Ppa-EplT4在发酵罐中进行高细胞密度发酵,产量进一步提高至55.30mg/L。对培养基上清进行收集,并通过镍柱亲和层析和分子筛层析对重组EplT4进行纯化,每升培养基可得到20mg纯化EplT4。实验发现,在进行高密度发酵时,EplT4蛋白会形成二聚体,并且二聚体的形成具有剂量效应。
　　将分离纯化得到的EplT4单体用于大豆诱导实验,结果表明EplT4单体能诱导大豆叶片的Beta-1-3葡聚糖酶,几丁质酶III-A,半胱氨酸蛋白酶抑制因子和过氧化物酶等病原相关蛋白基因的上调表达,并且能够诱导大豆叶片产过氧化氢和自发荧光反应等植物早期防御反应。经过EplT4诱导的大豆叶片显著增强了对大豆灰斑病(Cercospora sojina Hara)的抗病能力。以上结果表明重组EplT4单体蛋白能够有效增强大豆叶片的抗病性。
　　为了研究免疫诱导蛋白对生防菌的影响,通过农杆菌介导法分别成功构建了棘孢木霉和球毛壳菌的基因过表达体和缺失体。通过研究发现,基因的过表达或缺失对真菌自身的形态、生理功能方面影响较小,并且过表达体和缺失体在识别寄主和侵袭寄主上的能力没有变化。该基因对棘孢木霉T4菌丝的疏水性有影响,而对其孢子的疏水性没有影响,对球毛壳菌W7的菌丝和孢子的疏水性均没有影响。基因的缺失对它们定殖植物根部的能力均无明显改变。
　　将棘孢木霉的野生型,基因缺失体和过表达体分别用于大豆诱导试验。结果表明野生型和过表达体能够诱导大豆大部分病原相关蛋白基因的上调表达,引起大豆叶片的防御相关反应,并能增强其对病原真菌的抗病能力,而基因缺失体与对照相比差异不显著。棘孢木霉不仅能增强大豆的局部抗性,还能引发其系统抗病性。将球毛壳菌的野生型,基因缺失体和过表达体分别对大豆进行诱导试验。得到的结果与棘孢木霉基本相似,但病原相关蛋白的诱导能力有所差异,并且在进行诱导大豆抗灰斑病抗病试验时发现,EplW7基因的缺失并不能使其诱导抗性能力完全丧失,说明球毛壳菌内可能还存在其它诱导物质。
　　为研究EplT4和EplW7调控的分子机制,分别构建了棘孢木霉T4和球毛壳菌W7的cDNA文库,并分别将两个基因的启动子构建到报告载体pHIS2,与连有cDNA文库的pGADT7-Rec2表达载体共转化到酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Y187中,利用酵母单杂交系统分别筛选棘孢木霉和球毛壳菌cDNA文库中Epl基因的上游调控因子。共筛选到5个可能作用于EplT4的反式作用因子,分别是磷酸酶、信号识别受体、乙酰转移酶、假定蛋白1和假定蛋白2等。筛选到4个可能作用于EplW7的反式因子,分别是WD重复结构域蛋白、棕榈酰转移酶和2个假定蛋白。