咖啡因对斑马鱼脂肪肝的保护作用及其机制的初步研究

目的：
　　本研究通过建立饮食诱导的斑马鱼幼鱼NAFLD模型，同时探讨咖啡因对斑马鱼幼鱼肝内脂质聚集的影响及可能的机制。从而为研究NAFLD的发病机制和治疗药物的筛选提供实验模型。
　　方法：
　　1、确定斑马鱼幼鱼发生脂肪肝的最适喂养量和喂养时间
　　2、探讨咖啡因（caffeine）对饮食诱导的斑马鱼幼鱼肝脂肪变性的影响
　　3、初步探讨咖啡因(caffeine)减轻斑马鱼幼鱼脂肪肝的可能机制
　　4、尼罗红荧光染色活体标记和成像过度喂养斑马鱼幼鱼肝内脂滴和体内脂肪组织
　　结果：
　　1、过度喂养斑马鱼幼鱼明显发生了脂肪肝
　　通过测量不同喂养量和喂养时间幼鱼的体重和体长，结果分析显示幼鱼体重和体长随着每日喂养量的增加逐渐增加，喂养20天幼鱼体重(2.063±1.624mg)明显比喂养15天幼鱼(1.108±0.7363mg)重(P＜0.001)。同样地喂养20天幼鱼体长（6.587±1.220mm）比喂养10天幼鱼(4.885±0.5879mm)和喂养15天幼鱼（5.594±0.7336mm）明显长(P＜0.001)。然而，不同喂养组之间幼鱼的死亡率并没有统计学差异（P＞0.05）;喂养15天(19.25％)和喂养20天(21.47％)幼鱼死亡率明显比喂养10天幼鱼(7.83％)高(P＜0.01），而喂养15天幼鱼死亡率与喂养20天幼鱼死亡率无统计学差异(P＞0.05)。这些数据表明幼鱼死亡率与每日喂养量无关，而是取决于幼鱼本身内在的因素。整体油红O染色方法评估显示，随着喂养量的增加，幼鱼脂肪变性率逐渐升高;在每天喂养量120mg/d组和180mg/d喂养组幼鱼脂肪肝发生率可达80％以上，但是在不同喂养时间组之间幼鱼脂肪肝发生率无统计学差异(P＞0.05)。整体油红O染色、冰冻切片油红O染色和HE染色显示幼鱼喂养10天后出现肝内脂滴聚集，并且当幼鱼喂养到15天和20天后肝内脂滴数量增多，体积增大。然而，每日喂养量为20mg/d或30mg/d组幼鱼肝脏基本上没有脂质聚集，表明该喂养量能维持幼鱼正常的能量需要。而每日喂养量为120mg/d或180mg/d组幼鱼显示肝内大量的脂滴聚集，这表明在该喂养量条件下幼鱼处于能量过剩状态。此外，检测斑马鱼幼鱼体内甘油三酯(TG)和总胆固醇(TCH)的含量，结果表明180mg/d喂养组幼鱼喂养20天体内TG含量(0.0142±0.0035mmol/gprotein)明显比30mg/d喂养组幼鱼体内TG含量(0.0073±0.0034mmol/gprotein)高（P＜0.01）），而两组之间总胆固醇(TCH)含量并没有统计学差异(P＞0.05)。因此，这些数据表明在过度喂养条件下斑马鱼幼鱼易于发生肝脏脂肪变性，同时表明我们成功地建立了过度喂养诱导的斑马鱼幼鱼脂肪肝模型，并将喂养量为30mg/d，喂养20天的幼鱼定位正常喂养组，而喂养量180mg/d，喂养20天的幼鱼为过度喂养组。
　　2、咖啡因降低过度喂养斑马鱼幼鱼肝内脂质的聚集
　　许多流行病学和临床证据已表明咖啡和咖啡因对慢性肝脏疾病具有保护作用，因此我们研究咖啡因在过度喂养的斑马鱼幼鱼中是否具有降低肝内脂肪聚集的作用。首先，我们评估了咖啡因对幼鱼体重的影响。我们发现在2.5％、5％和8％caffeine喂养组幼鱼体重中比过度喂养组幼鱼体重明显减轻，但是在1％caffeine喂养组和过度喂养组之间幼鱼体重没有明显差别。正如幼鱼体重一样，2.5％、5％、8％cafeine喂养组幼鱼脂肪肝发生率和TG含量与过度喂养组比较明显降低，而1％caffeine喂养组和过度喂养组之间无差异。同时各不同喂养组之间总胆固醇含量并没有统计学差异。接着连续冰冻切片HE染色和油红O染色结果显示2.5％、5％和8％caffeine喂养组幼鱼肝内脂滴数量和脂滴体积比1％caffeine喂养组和过度喂养组幼鱼明显减少。这些数据表明咖啡因能减轻过度喂养诱导的幼鱼肝内脂质聚集。
　　3、咖啡因参与调控脂质代谢通路、内质网(ER)应激和炎症反应相关的基因表达
　　为了探索咖啡因减轻肝内脂滴聚集的可能机制，我们检测了参与调控脂质代谢基因的表达水平。qPCR结果显示与过度喂养组幼鱼相比，参与脂肪酸摄入的转运蛋白的基因表达水平在5％caffeine喂养组中明显的降低，如脂肪酸转运酶基因(FAT/CD36);解耦联蛋白-2(UCP-2)基因和参与脂质形成的转录因子基因如固醇调节元件结合转录因子-1（SREBP-1）表达水平也降低;参与脂肪酸合成的关键酶乙酰CoA羧化酶-1(ACC1)和脂肪酸合成酶(FASN)表达含量也明显降低。然而，参与脂肪酸β-氧化过程的乙酰CoA氧化酶(ACO)基因表达水平在5％caffeine喂养组中明显升高。接着我们在过度喂养的幼鱼中探索咖啡因是否能影响ER功能而发挥保护肝脏的作用。qRT-PCR结果显示过度喂养组组中参与ER应激的基因表达水平明显比对照组(30mg/d)升高，包括基因IRE1、BIP和CHOP。咖啡因喂养后，基因BIP和IRE1表达量明显下降，并且ATF6和PERK的mRNA水平在咖啡因喂养组中也明显降低，这表明咖啡因可下调参与ER应激的相关基因。进一步我们检测了炎症因子基因的表达水平，观察咖啡因是否可调节炎症反应。结果显示与正常喂养组比较，过度喂养组幼鱼肝组织中炎症因子IL-1β和TNF-α表达含量明显增加;而5％caffeine喂养后其表达含量又明显降低;NF-κB的表达量各组之间没有差异。除此之外，咖啡因处理后自噬相关基因ATG12和Beclin-1的表达水平降低。因此，这些结果表明咖啡因可能通过抑制脂质形成和脂肪酸摄入，改善内置网功能及减轻肝内炎症反应而减轻幼鱼肝内的脂质聚集。
　　4、尼罗红染色活体标记和成像过度喂养幼鱼肝内脂滴和体内脂肪细胞
　　我们选择过度喂养20天幼鱼，经过尼罗红染液处理后，在荧光显微镜下观察。结果发现在幼鱼肝内和腹腔部位有明显的强烈桔黄色信号，表明幼鱼存在肝内脂滴和腹腔脂肪细胞聚集。同时整体油红O染色，白光显微镜和HE切片进一步证实肝内脂滴和腹部脂肪细胞的存在。接着我们运用尼罗红染色观察不同喂养时间幼鱼体内脂肪组织的发生和分布。尼罗红染色结果显示5dpf斑马鱼幼鱼还未被完全吸收的卵黄囊。过度喂养2天的幼鱼(即9dpf)胰腺位置出现中性脂质聚集，表明脂肪细胞最先出现在胰腺部位;喂养5天的幼鱼(12dpf)腹腔中开始出现小脂滴，提示存在脂肪细胞聚集;而随着喂养时间延长腹腔脂肪细胞聚集明显增多，脂肪细胞出现的部位除腹腔外，还出现在其他部位如胸鳍部，眼眶周围，尾鳍部，心包周围，下颌部，皮下和背部。这表明随着喂养时间延长斑马鱼体内脂肪细胞数量和出现部位逐渐增加，说明不同部位脂肪组织的发生并不是同步的，斑马鱼脂肪组织的形成按一定的顺序存在时间和空间上的调控。此外，发现在过度喂养下斑马鱼肝脏在喂养5天后可出现明显的脂质聚集，之后肝内脂质聚集一直存在，表明斑马鱼易于发生肝内脂质聚集。接着我们运用尼罗红纵向观察饥饿后斑马鱼脂肪组织和肝内脂滴变化。首先，尼罗红染色过度喂养的27dpf斑马鱼显示腹腔内脂肪细胞聚集和肝内脂滴形成。而在斑马鱼饥饿1、2和4天后，腹腔脂肪组织明显逐渐减少，肝脏体积和肝内脂滴数量也逐渐减少。在饥饿5天后，腹腔内脂肪组织和肝内脂滴基本消失，表明在饥饿状态时，斑马鱼动用脂肪组织的脂肪和肝内脂质维持能量供应。为了证明斑马鱼在重新给予喂养后脂肪组织重新出现，我们对饥饿5天后斑马鱼给予喂养。尼罗红染色发现喂养2天后，斑马鱼腹腔内又出现小脂滴，在重新喂养5天后，斑马鱼腹腔内中性脂质明显增加，而肝内脂滴变化不是很明显。这表明饥饿的斑马鱼重新喂养后，脂肪细胞可重新聚集脂质。
　　结论：
　　1、成功建立饮食的诱导的斑马鱼幼鱼脂肪肝模型，为研究NAFLD发病机制和治疗药物的筛选提供新的动物模型。
　　2、咖啡因可通过降低脂肪酸摄入、脂质合成和炎症相关因子基因的表达，上调脂质氧化相关基因，同时改善内质网功能而减轻斑马鱼幼鱼肝内脂质的聚集。
　　3、尼罗红荧光染色活体标记和成像斑马鱼幼鱼体内脂肪组织和肝内脂滴，为活体观察体内脂肪组织的发育和肝内脂质聚集提供良好的实验方法。