目的:
发现miR-152在肝细胞脂质代谢中的作用;验证WNT是miR-152靶基因并进一步探讨miR-152抑制WNT信号通路促进肝细胞脂肪变性的分子机制。
方法
首先,利用慢病毒技术,构建miR-152过表达慢病毒和miR-152沉默慢病毒,分别转染人正常肝细胞和人肝癌细胞中,得到miR-152过表达组细胞(Lenti-miR-152)、miR-152沉默组细胞(Lenti-152-In)和空载对照组细胞(Lenti-NC),RT-PCR验证miR-152表达;棕榈酸和油酸(1mM)干预Lenti-miR-152、Lenti-152-In和Lenti-NC组细胞后,采用油红O染色和甘油三酯测定试剂盒检测脂质合成情况;同时,通过构建荧光素酶报告基因质粒,结合生物信息学分析结果验证miR-152靶基因;对Lenti-miR-152、Lenti-152-In和Lenti-NC分别在mRNA水平和蛋白水平检测WNT信号通路以及下游脂质合成关键转录因子的表达水平,探讨miR-152通过抑制WNT信号通路促进肝细胞脂肪变性的分子机制。最后分别检测Lenti-miR-152、Lenti-152-In和Lenti-NC组细胞ATP含量和线粒体拷贝数,探讨miR-152对线粒体功能的调控作用。
结果:
RT-PCR验证miR-152表达证实成功构建miR-152过表达和miR-152沉默肝细胞。油红O染色结果显示miR-152促进肝细胞脂滴聚积;miR-152过表达组细胞甘油三酯含量高于空载组;miR-152沉默对肝细胞脂肪代谢影响不大。经生物信息学分析发现,Wnt10b是miR-152的靶基因,双荧光素酶报告基因系统结果证实miR-152直接结合于Wnt10b的3'UTR区;同时,Western blot结果显示miR-152能直接抑制Wnt10b的表达。RT-PCR与Western blot显示miR-152增加GSK-3β磷酸化水平,促进β-Catenin降解,抑制β-Catenin进入肝细胞核内,上调脂质合成关键转录因子SREBP-1c和PPARγ的表达。最后,miR-152明显降低肝细胞内ATP含量和线粒体拷贝数。
结论:
miR-152抑制Wnt10b,促进肝细胞发生脂肪变性和线粒体损伤,miR-152可能成为NAFLD防治的潜在的靶标。