杜仲MEP途径系列基因全长cDNA分离鉴定及序列特征研究

杜仲（Eucommia ulmoides Oliv.）是我国特有的第三纪孑遗植物，也是优良的温带胶源树种和名贵药用树种。杜仲萜类化合物广泛应用于人们生产生活，其中最为重要的是杜仲胶和环烯醚萜类。2-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸（2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate，MEP）途径是植物萜类生物合成上游重要的调控路径之一。本研究以杜仲叶片转录组测序数据为基础，分离鉴定MEP途径所有相关酶高表达水平基因的cDNA全长，并利用生物信息学方法对序列特征、结构特点及基因功能进行分析和预测，旨为潜在功能基因的筛选和挖掘，合成途径中限速步骤的深入探究以及为萜类代谢工程靶点的确定和基因改良育种提供基础信息。
　　1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶DXS是MEP途径中的第一个关键酶，在杜仲中发现两个DXS酶基因家族成员，分别命名为EuDXS1和EuDXS2。EuDXS1基因cDNA全长2805 bp，5’端非编码区长218 bp，3’端非编码区长448 bp，编码712个氨基酸，与美丽帽柱木DXS基因序列相似性最高，达81％；EuDXS2基因cDNA全长2552 bp，5’端非编码区长73 bp，3’端非编码区长337 bp，编码713个氨基酸，与橡胶DXS基因序列相似性最高，达82%。推导EuDXS1与EuDXS2氨基酸序列中均包含转运肽序列（A1-A18；A1-A34）、TPP结合基序（A106-A360；A108-A362）、嘧啶结合基序（A397-A553；A399-A555）和转酮醇酶C末端基序（A571- A676；A573-A678）等植物DXS蛋白典型的保守基序与功能位点。推导 EuDXS1与EuDXS2蛋白二级结构均以螺环结构为主，分别占48.74%和49.37%。推导EuDXS1和EuDXS2蛋白三级结构分别由两个亚单位组成。EuDXS1蛋白与蓖麻DXS1蛋白亲缘关系最为接近，EuDXS2蛋白与橡胶DXS2蛋白亲缘关系最为接近。
　　1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶DXR是MEP途径中的第二个限速酶，在杜仲中分离鉴定出两个DXR酶基因家族成员，分别命名为EuDXR1和EuDXR2。EuDXR1基因cDNA全长1814 bp，5’端非编码区长126 bp，3’端非编码区长251 bp，编码478个氨基酸，与毛果杨DXR基因序列的相似性最高，达81%；EuDXR2基因cDNA全长1779 bp，5’端非编码区长163 bp，3’端非编码区长251 bp，编码472个氨基酸，与葡萄DXR基因序列的相似性最高，达81%。推导EuDXR1与EuDXR2氨基酸序列中均包含转运肽序列（A1-A51；A1-A43），具有2个DXR蛋白结合基序（A227-A236，A297-A307；A221-A230，A291- A301），2个NADPH结合基序（A88-A94，A113-A119；A82-A88，A107-A113）以及N端富脯氨酸基序（A61-A69；A55-A63）等植物 DXR蛋白典型的保守基序与功能位点。推导EuDXR1与EuDXR2蛋白二级结构均以螺环结构为主，分别占47.91%和45.34%。推导EuDXR1和 EuDXR2蛋白三级结构分别由两个亚单位组成，在空间上呈“V”字结构。EuDXR1蛋白与水稻DXR1蛋白亲缘关系最为接近，EuDXR2蛋白与玉米DXR2蛋白亲缘关系最为接近。
　　2-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸胞苷酰转移酶MCT催化MEP途径的第三步酶促反应，在杜仲中分离出一个MCT酶基因，命名为EuMCT。EuMCT基因cDNA全长1435 bp，5’端非编码区长223 bp，3’端非编码区长252 bp，编码319个氨基酸，与葡萄MCT基因序列相似性最高，达82%。推导 EuMCT氨基酸序列中包含转运肽序列（A1-A75）以及植物MCT蛋白多个保守的功能位点（A100，A102，A103，A104，A105，A106，A114，A170，A171，A173，A176，A195，A196，A198，A228，A244，A250，A252，A300）。EuMCT蛋白二级结构中α-螺旋占23.82%，β-折叠占18.18%，螺环结构占57.99%。EuMCT蛋白三级结构由两个亚单位组成，并且存在两个特殊的P-loop结构。EuMCT蛋白与葡萄MCT蛋白亲缘关系最为接近。
　　4-（5’-焦磷酸胞苷）-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶CMK催化MEP途径的羟基磷酸化反应，在杜仲中分离出一个CMK酶基因，命名为EuCMK。EuCMK基因cDNA全长1644 bp，5’端非编码区长256 bp，3’端非编码区长203 bp，编码394个氨基酸，与番茄CMK基因序列相似性最高，达82%。EuCMK氨基酸序列中包含转运肽序列（A1-A57）以及植物CMK蛋白催化过程中所必需的ATP结合位点（A186-A202）。推导EuCMK结构α-螺旋占32.74%，β-折叠占19.29%，螺环结构占47.97%。推导EuCMK蛋白三级结构由两个不对称的亚基组成。EuCMK蛋白与葡萄CMK蛋白亲缘关系最为接近。
　　2-甲基-D-赤藓醇-2，4-环焦磷酸合酶MDS催化MEP途径的第五步酶促反应，在杜仲中分离出一个MDS酶基因，命名为EuMDS。EuMDS基因cDNA全长976 bp，5’端非编码区长119 bp，3’端非编码区长146 bp，编码236个氨基酸，与紫茎泽兰MDS基因序列相似性最高，达79%。EuMDS氨基酸序列中包含转运肽序列（A1-A56）以及多个植物MDS蛋白保守的功能位点（A84，A87，A89，A121，A213，A217，A221，A223，A228）。推导EuMDS蛋白二级结构中α-螺旋占40.25%，β-折叠占13.56%，螺环结构占46.19%。推导 EuMDS蛋白三级结构由三个亚单位组成，并相互围绕形成一个分子内腔。EuMDS蛋白与啤酒花MDS蛋白亲缘关系最为接近。
　　1-羟基-2-甲基-2-E-丁烯基-4-焦磷酸合酶HDS为MEP途径的第六个作用酶，在杜仲中分离出一个HDS酶基因，命名为EuHDS。EuHDS基因cDNA全长2786 bp，5’端非编码区长171 bp，3’端非编码区长383 bp，编码743个氨基酸，与葡萄HDS基因序列相似性最高，达84%。推导 EuHDS氨基酸序列中包含转运肽序列（A1-A30）、PSN基序（A58-A78）、PSI基序（A354-A620）以及植物HDS蛋白3个绝对保守的半胱氨酸位点（A644，A647，A678）。推导EuHDS蛋白二级结构α-螺旋占37.55%，β-折叠占19.25%，螺环结构占43.20%。推导EuHDS蛋白三级结构N端为一个属TIM-barrel超家族的八链β桶形结构，C端为一个两侧翼为螺旋结构的β折叠构造。EuHDS蛋白与葡萄HDS蛋白的亲缘关系最为接近。
　　1-羟基-2-甲基-2-E-丁烯基-4-焦磷酸还原酶HDR是MEP途径中的第三个关键酶，在杜仲中分离出一个HDR酶基因，命名为EuHDR。EuHDR基因cDNA全长1653 bp，5’端非编码区长82 bp，3’端非编码区长188 bp，编码460个氨基酸，与喜树HDR基因序列相似性最高，达82%。推导 EuHDR氨基酸序列中包含转运肽序列（A1-A33）以及植物HDR蛋白多个保守的功能位点（A117，A208，A262，A345）。推导EuHDR蛋白二级结构α-螺旋占35.65%，β-折叠占19.78%，螺环结构占44.57%。推导EuHDR蛋白三级结构为单体形式，呈不规则的三叶草形状。EuHDR蛋白与葡萄HDR蛋白的亲缘关系最为接近。
　　异戊烯基焦磷酸异构酶IPI催化IPP与DMAPP之间的可逆转化，是萜类代谢网络的一个枢纽，在杜仲中分离出一个IPI酶基因，命名为EuIPI。EuIPI基因cDNA全长1231 bp，5’端非编码区长79 bp，3’端非编码区长231 bp，编码306个氨基酸，与喜树IPI基因序列相似性最高，达84%。推导EuIPI氨基酸序列包含转运肽序列（A1-A70）以及植物IPI蛋白典型的功能位点（A154、A175，A107、A119、A156、A196、A206、A208）。推导EuIPI蛋白二级结构α-螺旋占22.55%，β-折叠占13.40%，螺环结构占64.05%。EuIPI蛋白三级结构以单体形式存在。EuIPI蛋白与欧洲榛IPI蛋白的亲缘关系最为接近。