砷诱导人正常膀胱上皮细胞增殖和血管发生相关因子表达的机制研究

前言：
　　砷是环境中普遍存在的化学元素，人主要是通过职业和饮用含砷地下水暴露于高砷环境中，砷中毒已是全世界面临的严重的公共卫生问题。2004年国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer，IARC)确定砷是人类的致癌物，主要可以引起皮肤癌、肺癌和膀胱癌等。其中膀胱癌在砷所致的内脏系统肿瘤中排在第二位，死亡率较高，近年来备受关注。但是，砷诱发膀胱癌的机制目前尚不清楚。
　　肿瘤的的发生、发展离不开新血管的发生和异常的细胞增殖。在机体癌变前其实已经发生了增殖和血管发生相关因子表达的改变。有文献报道长期低剂量砷暴露可以引起人正常肺内皮细胞BEAS-2B血管发生和细胞增殖过度及发生转化。但是在高砷暴露人群的尿液中以及人膀胱上皮细胞是否会发生血管发生和增殖相关因子改变目前鲜有报道。
　　血管发生是肿瘤发生初始阶段的重要事件。缺氧诱导因子(Hypoxia-inducible factor，HIF-1)是参与调控血管发生的重要转录因子，HIF-1由HIF-1α亚基和HIF-1β亚基组成。HIF-1β是芳香烃受体核转运分子，在细胞核内稳定表达，活性不受缺氧的影响。HIF-1α对氧敏感，缺氧可诱导其蓄积，是HIF-1发挥生物活性的主要亚单位。HIF-1α能激活100多种应答基因，其中包括很多与肿瘤相关的因子，如:最有效的生血管因子之一血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)、胰岛素样生长因子(Insulin-Like Growth Factor，IGF)、红细胞生成素(erythropoietin，EPO)等，使肿瘤细胞适应缺氧引起的微环境改变，并且不断增殖、浸润和转移。
　　从细胞增殖角度看，肿瘤是一种细胞周期紊乱性疾病，表现为加速细胞增殖而凋亡发生障碍。当细胞周期调控异常时，细胞进入病理状态——变性或恶性增殖。细胞周期中有两个关键限制点:G1/S和G2/M限制点。其中G1/S限制点是决定细胞去向的关键，细胞周期素D1(CyclinD1)是G1期的细胞增殖信号的关键蛋白，与细胞周期蛋白依赖性激酶(Cyclins-dependent kinase，CDKs)中的CDK4或CDK6结合，形成复合体，促进细胞通过G1/S限制点。细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白（Cyclins-dependent kinase inhibitor，CKIs）是CDK抑制蛋白，对细胞生长起负调控作用，如p16特异性抑制CDK4-CyclinD1，p21能抑制大多数CDK的激酶活性，还能与DNA聚合酶δ的辅助因子细胞增殖核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)结合，直接抑制DNA的合成，参与细胞应激状态时的信号转导级联系统的调节。
　　细胞丝裂原活化蛋白激酶信号传导通路(mitogen activated protein kinase signaling pathway，MAPK)和磷脂酰肌醇（-3）激酶/蛋白激酶B信号传导通路(phosphatidylinositol-3-OH kinase/protein kinase B，PI3K/AKT)能接受细胞外信号，通过传导分子和活化转录因子，引起靶基因的活化。大量文献报道，MAPK和PI3K/AKT信号通路均参与了促进血管发生相关因子(HIF-1α、VEGF)和细胞增殖相关因子(CyclinD1)的活化和表达。
　　膀胱癌的生物标记——环氧化酶（cyclooxygena-2，COX-2）是催化花生四烯酸生成前列腺素过程的关键酶，我们实验室前期研究已经发现人正常膀胱上皮细胞(SV-HUC-1)经砷处理24小时后，COX-2的蛋白和mRNA均显著表达，其机制可能是通过砷产生的活性氧自由基(Reactive oxygen species，ROS)而激活MAPK/ERK信号通路，诱导了COX-2的表达。但MAPK并非诱导COX-2表达的唯一通道，在子宫内膜癌的研究中发现，MAPK/ERK通路和PI3K/AKT通路均能激活COX-2。活化的COX-2作为炎性因子在促进血管发生和细胞增殖方面也发挥着重要的促进作用。因此，本研究选取了职业高砷暴露人群，通过检测高砷暴露人群尿砷化物含量、VEGF和PGE2水平，分析甲基代谢能力和砷化物含量与尿VEGF、PGE2水平之间的关系。并开展体外细胞实验，以COX-2为出发点，通过测定低剂量砷暴露对人正常膀胱上皮细胞（SV-HUC-1）增殖相关因子(CyclinD1、CDK4、p21、p16、p27、Bcl-2/Bax)和血管发生相关因子(HIF-1α、VEGF)表达的变化情况及参与调控的相关通路，从细胞增殖和血管发生的角度进一步探索砷致膀胱癌的机制。
　　材料与方法：
　　1、研究对象
　　在辽宁省内选择106名从事金属铜冶炼的男性，并且没有炎症和心脏、肝、肾等器官功能障碍以及其他恶性疾病。经受试者知情同意和中国医科大学伦理委员会批准，通过问卷获取受试者信息:年龄，身高，体重，工作史，饮食（包括3天内海鲜，肉类，果蔬的摄入量），吸烟习惯，饮酒，疾病史，饮用水等，并测量受试者血压。
　　2、尿液样品采集
　　采集受试者尿液样本10ml于无菌的15ml离心管中，置于0-4℃冰盒中，运到中国医科大学实验室，4℃2000rpm离心5min，收集上清，-80℃保存待测。
　　3、尿肌酐测定
　　用血、尿肌酐测定试剂盒（苦味酸法）对尿液样本Cr浓度进行测定。尿液样本用蒸馏水1∶200稀释，取稀释尿样1.6ml加入0.5ml苦味酸溶液和0.75mol/L氢氧化钠溶液0.5ml。均匀混合上述各试剂，在37℃水浴10min，取出后用流水冷却，1cm光径，波长510nm，空白管调零，测定各管吸光度值。标准品为10μMol/LCr，空白为蒸馏水。
　　4、尿形态砷测定
　　采用氢化物发生-冷井捕集-原子吸收分光光度法检测样品中不同形态砷。1ml尿液用2M NaOH 100℃消化3h，每1h用磁力搅拌器搅拌一次。根据不同形态砷的沸点不同测样品中的无机砷(iAs)，一甲基砷(MMA)，二甲基砷(DMA)含量，各形态砷的和为总砷(TAs)。用不同形态砷占总砷的百分比(iAs％，MMA％，DMA％)和一甲基化率(PMI)、二甲基化率(SMI)反映机体的甲基化代谢能力。
　　5、细胞培养与砷处理
　　SV-HUC-1细胞系是人正常尿路上皮细胞株（购自美国典型菌种保藏中心ATCC，编号:CRL-9520），于95％空气、5％CO2、37℃条件下常规培养于F12K完全培养基（10％胎牛血清，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素）。隔天换液，一般以1∶3传代培养。细胞接种至培养皿，待铺满培养皿底面80％，换液，以F12K完全培养基配制不同浓度的NaAsO2溶液，进行细胞染毒。染毒时间为24h，染毒终点倒置显微镜下观察细胞形态及生长状况，并采集图像。
　　6、细胞内ROS水平检测
　　SV-HUC-1细胞染毒后，PBS洗两次，加入荧光探针2'，7'-二乙酰二氯荧光素(DCFH-DA)工作液(终浓度为10μMol/L)，37℃下孵育30min后PBS清洗2次，部分染色的细胞在倒置荧光显微镜下观察。收集其余细胞，用流式细胞仪检测细胞内ROS水平，激发波长488nm，发射波长525nm，每次计数1×104个细胞，用Cell Quest软件进行分析。
　　7、细胞内O2·-水平检测
　　经砷处理后的SV-HUC-1细胞PBS洗两次，加入二氢乙啶(DHE)荧光探针终浓度为5μMol/L），37℃避光孵育30min，再用PBS洗3次，部分染色的细胞在倒置荧光显微镜下观察。收集其余细胞，用流式细胞仪检测细胞内O2·-水平，激发波长300nm，发射波长610nm，用Cell Quest软件进行分析。
　　8、RNA提取及RT-PCR检测
　　从GenBank下载相应的cDNA序列，根据文献和专用设计软件Primer5设计并合成对应的mRNA引物。经染毒处理的细胞用常规方法trizol提取细胞内总RNA，并于-80℃冰箱保存。采用两步法反转录mRNA为cDNA并扩增其产物。以β-ACTIN作为内对照，用琼脂糖胶电泳观察结果。
　　9、Western blot免疫印迹检测蛋白表达
　　收集经染毒处理的细胞，加入细胞裂解液裂解细胞，提取细胞的总蛋白以及核蛋白和胞浆蛋白。核蛋白和胞浆蛋白提取按照试剂盒说明书进行，BCA法测定蛋白浓度，将蛋白保存于-70℃保存。加样前保证各蛋白浓度一致，然后蛋白质开始SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。随后，蛋白质从SDS-PAGE转移至PVDF膜，封闭后根据不同的靶蛋白参照一抗的说明书分别加入相应的一抗，使之靶蛋白的结合，然后再参照二抗的说明书加入相应的二抗再次杂交。ECL化学发光反应后曝光、扫描、定量分析。
　　10、BrdU培养细胞免疫荧光
　　溴化脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)可以在体内和体外掺入到处于S期的细胞所合成的DNA链中，主要用于研究各种不同的因素对正常/肿瘤组织的细胞增殖及动力学的研究。细胞于24孔板中培养24h后，加入亚砷酸钠处理24h，在处理的最后15h加入BrdU（终浓度为10μM）进行孵育。用PBS洗细胞2次，加入4％的多聚甲醛固定20min，再加入0.3％Triton(X)-100孵育10min，PBS漂洗两次。再加入2NHCL于37℃孵育30min以使DNA变性，再在1％BSA（PBS配置）中于37℃孵育30min。Mouseanti-BrdU（用PBS稀释至1∶100）覆盖细胞表面4℃避光过夜。PBS漂洗三次后，室温孵育二抗(CY3-conjugated anti-BrdU antibody)1h。再PBS漂洗两次，加入4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染细胞核，最后PBS洗两次细胞，荧光倒置显微镜下观察细胞进行计数并记录，结果用BrdU/DAPI的比值来表述。
　　11、流式细胞法分析细胞周期
　　经不同浓度亚砷酸钠处理24h的细胞用蛋白酶消化并收集，PBS洗两次，离心收集，然后用70％乙醇固定，4℃过夜，再次悬浮细胞，进行离心(5min，1000g)和洗细胞。加入300μL碘化丙啶(PI)在37℃避光条件下孵育30min。细胞周期用流式细胞仪分析（Becton-Dickinson，美国），激发波长为488nm。
　　12、ELISA法检测VEGF和PGE2水平
　　VEGF和PGE2水平通过ELISA（博士德，武汉，中国）（R&D公司，美国）方法检测。收集SV-HUC-1细胞培养上清液，1000g离心20min后取上清加入酶标板，根据说明书测定VEGF和PGE2水平。
　　13、统计分析
　　采用SPSS13.0统计软件进行数据分析。对人群资料的分析，根据尿砷TAs的水平，将受试者分为三组:组1:TAs＜35μg/L;组2:TAs在35-100μg/L之间;组3:TAs＞100μg/L。结果用(x)±SD表示，采用Kolmogorov-Smirnov检验数据正态性。正态及对数转化后服从正态分布的数据采用参数检验对其分析，各组间比较采用ANOVA（LSD或DunnettT3检验）分析其统计学差异。非正态分布的数据采用非参数检验。阳性率比较采用卡方检验。尿VEGF、PGE2水平与尿中砷化物的浓度和个体甲基代谢能力之间的关系采用Pearson和Spearman相关分析。应用多元线性回归分析尿VEGF和PGE2与尿各砷化物、甲基化能力的联系强度。以p＜0.05为差异有统计学意义。
　　实验结果以均数（(x)±SD）表示。采用单因素方差分析(ANOVA)比较各实验组与对照组间的统计学差异，组间比较采用LSD或Dunnett's检验。两独立样本间比较采用t检验。以p＜0.05为差异有统计学意义。
　　结果：
　　1、职业砷暴露人群尿中各种砷化物和VEGF和PGE2浓度的分析
　　iAs、MMA和DMA三种形态砷化物均在组3中含量最高，组2和组3中的含量高于组1，且组3高于组2。组3的iAs％最低，MMA％最高，而DMA％三组间无统计学差异。组3的PMI最高，而SMI最低，且差异有统计学意义。
　　组2和组3的尿VEGF水平较组1显著增加，组3中尿PGE2有高于组2的趋势，但差异无统计学意义。
　　2、职业砷暴露人群尿中VEGF和PGE2浓度与尿砷化物及机体甲基代谢能力的关系
　　尿VEGF和PGE2含量均与iAs、MMA、TAs水平显著正相关，VEGF还与DMA呈显著正相关。个体的甲基化能力也对VEGF和PGE2水平有很大影响，VEGF和PGE2水平均与MMA％正相关，与SMI负相关，并且VEGF水平与DMA％也呈负相关关系。
　　采用多元线性回归模型进一步探讨尿中各种砷化物浓度对VEGF和PGE2含量的影响。排除年龄、工龄、吸烟、BMI、近3日海产品摄入和饮酒等行为因素，发现iAs，MMA，DMA和TAs水平均对VEGF有显著影响，除DMA外，其他砷化物对PGE2含量也有显著影响。
　　3、亚砷酸钠致SV-HUC-1细胞氧化应激
　　细胞经0、1、2、4、8、10μMNaAsO2处理24h，流式细胞仪检测和荧光倒置显微镜观察的结果显示:细胞内ROS和O2·-水平均升高，在4、8、10μMNaAsO2处理组ROS和O2·-水平显著升高，并呈现明显的剂量反应关系。这说明亚砷酸钠能引起SV-HUC-1细胞氧化应激。
　　4、亚砷酸钠诱导SV-HUC-1细胞血管发生因子（HIF-1α、VEGF）表达增强
　　SV-HUC-1细胞经NaAsO2(0、1、2、4、8、10μM)处理24h，HIF-1α的蛋白水平在4、8、10μM组较0剂量组显著升高，mRNA水平在8和10μMNaAsO2组显著升高，并且蛋白和mRNA水平与NaAsO2处理剂量呈显著正相关。VEGF的蛋白水平在4μM处理组达到最高，mRNA在10μM处理组达到最高，并与NaAsO2处理剂量呈显著正相关。这说明砷能诱导SV-HUC-1细胞血管发生因子HIF-1α、VEGF表达增强。
　　5、亚砷酸钠诱导SV-HUC-1细胞增殖
　　BrdU掺入实验检测细胞增殖。细胞与Brdu孵育15h，在倒置荧光显微镜下观察到4μMNaAsO2处理组BrdU标记的阳性率显著高于0剂量组，而10μMNaAsO2处理组显著低于0剂量组。这一结果提示我们低剂量砷可能促进细胞增殖，而高剂量砷能诱导细胞凋亡。
　　我们进一步用流式细胞仪检测细胞周期的变化。实验发现4μMNaAsO2处理组的G1期细胞所占比例明显下降，而S期细胞所占比例明显增多。这说明4μMNaAsO2能缩短G0-G1期，进而使细胞周期加速，促进增殖。
　　6、亚砷酸钠诱导SV-HUC-1细胞增殖相关因子(CyclinD1、CDK4、p21、p16、p27、Bcl-2/Bax)蛋白表达改变
　　为确定是否砷促进了细胞跨越G1/S细胞周期检查点，我们检测了G1的关键蛋白。研究发现CyclinD1 RNA和蛋白均在4μMNaAsO2处理组达到峰值。Bcl-2/Bax在1和2μMNaAsO2处理组有上升趋势，在8、10μMNaAsO2处理组呈下降趋势，但差异无显著性。CDK4蛋白在0-4μMNaAsO2处理组中基本保持稳定，在8和10μMNaAsO2处理组表达显著下降。p16和p27蛋白与染砷剂量呈显著负相关。p21是参与负向调节细胞周期的重要蛋白。p21的功能取决于它的细胞内定位。当p21蛋白定位在细胞质中，它作为一种促癌基因调节细胞的迁移，增殖。我们的实验检测胞浆中的p21发现在1-4μMNaAsO2处理组p21显著增高，进一步说明低剂量砷对细胞增殖发挥了促进作用。
　　7、亚砷酸钠诱导SV-HUC-1细胞COX-2及其产物PGE2表达增高
　　经砷处理的SV-HUC-1细胞COX-2的mRNA和蛋白水平均均有所增加，并且在4μMNaAsO2剂量下达到峰值。PGE2的分泌水平也显著增加，并与染砷剂量显著正相关。在4μMNaAsO2组加入COX-2抑制剂后，PGE2的分泌水平明显降低。这说明砷诱导COX-2表达增高促进了PGE2的分泌。
　　8、亚砷酸钠激活PI3K/AKT信号传导通路
　　经亚砷酸钠处理24h后，SV-HUC-1细胞AKT磷酸化水平增加，PI3K/AKT信号通路的负向调控因子PTEN表达水平下降，并与染砷剂量显著负相关。说明PI3K/AKT信号传导通路被活化。
　　9、SV-HUC-1细胞系中，PI3K/AKT/COX-2和MAPKs/COX-2信号传导通路参与砷引起的HIF-1α、VEGF、CyclinD1表达
　　SV-HUC-1细胞经砷处理后，AKT、ERK、JNK和p38的磷酸化水平均显著升高，SV-HUC-1细胞在染砷前加入PI3K、ERK、JNK和p38，再经砷处理24h，发现HIF-1α、VEGF、CyclinD1和COX-2的蛋白水平出现了不同程度的下降。并且COX-2抑制剂(NS-398)也显著抑制了VEGF、CyclinD1的蛋白表达，这说明PI3K/AKT/COX-2和MAPKs/COX-2信号传导通路参与砷引起的HIF-1α、VEGF、CyclinD1表达。
　　10、SV-HUC-1细胞系中，抗氧化剂在HIF-1α、VEGF、CyclinD1表达中的作用
　　为探讨砷诱导产生的ROS在血管发生和细胞增殖中的作用机制，SV-HUC-1细胞在砷处理前用抗氧化剂夹竹桃麻素(apocynin)（NADPH氧化酶抑制剂）和褪黑素(MEL)预处理，结果发现apocynin不仅抑制ERK1/2、JNK、p38和AKT的磷酸化，而且也显著抑制了HIF-1α、VEGF、COX-2蛋白的表达以及VEGF和PGE2的分泌。褪黑素(MEL)是一种有效的广谱自由基清除剂，我们发现MEL也能显著抑制HIF-1α、VEGF、COX-2和CyclinD1蛋白的表达以及VEGF和PGE2的分泌。这一结果表明砷诱导的细胞氧化应激通过活化MAPKs和PI3K/Akt信号通路，进而增加HIF-1α，VEGF、COX-2和CyclinD1的表达。
　　结论：
　　1、高砷暴露人群尿液中VEGF和PGE2水平升高，并与尿砷化物浓度和个体对砷的甲基代谢能力有关。
　　2、亚砷酸钠诱导SV-HUC-1细胞血管发生因子(HIF-1α、VEGF)表达增强。
　　3、低剂量亚砷酸钠能促进SV-HUC-1细胞增殖。
　　4、亚砷酸钠诱导SV-HUC-1细胞COX-2及其产物PGE2表达增高。
　　5、砷能诱导SV-HUC-1细胞氧化应激，活化PI3K/AKT/COX-2和MAPKs/COX-2信号传导通路，进而增加HIF-1α、VEGF、CyclinD1的表达。