猪用复合益生菌制剂的研制与应用

本研究旨在筛选出能与实验室前期筛得的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)YB-DY-1和酿酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）P-1形成良好协同作用的乳酸菌，以期研制出高效猪用复合益生菌制剂。内容包括益生乳酸菌筛选，复合益生菌制剂的研制及其饲喂生长猪、妊娠母猪与断奶仔猪的效果评价，具体为以下4部分。
　　1.猪源益生乳酸菌的筛选、分离及鉴定。为获得高效的猪源益生乳酸菌，采集健康猪肠道组织，冲洗肠道表面内容物，从肠道黏膜中分离、纯化出乳酸菌，经过体外耐胆盐、耐酸、抑制病原菌和安全性评价试验，筛选出性能优良的益生菌株，并进行分子生物学鉴定。结果从分离纯化出的44个菌株中，成功筛选到一株源自回肠的高效菌株RS-018，其耐受0.3％猪胆盐和pH2.5的存活率分别为86.21％和85.06％，对大肠杆菌K88、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径分别为21.64mm、13.01mm和16.29mm，16S rDNA序列长度为1490bp，鉴定为罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri），且对小鼠的安全性无异常。结果提示，筛得的罗伊氏乳杆菌RS-018可作为研制猪用益生菌制剂的备用菌株。
　　2.复合益生菌制剂的研制。为研制出活菌数较高的猪用复合益生菌制剂。将筛得的罗伊氏乳杆菌RS-018与地衣芽孢杆菌YB-DY-1和酿酒酵母菌P-1复合制成益生菌制剂，以总活菌数为优选指标，优化三菌液态发酵共培养工艺及固态发酵（Solid-state fermentation，SSF）工艺，并采用冷冻干燥法和烘干法优化益生菌固态发酵产物的干燥工艺。结果表明，三菌液态共培养的最佳工艺为:先同时接种1％RS-018和1％P-1种子液，35℃静置培养12h后，再接种5％YB-DY-1种子液，37℃，150r/min，震荡培养24h，在此条件下发酵液中三菌活菌总数可达1.24×109cfu/ml，且每种菌的活菌数均＞108cfu/ml;固态发酵最佳发酵条件为:混菌种子液接种量5％，基质初始水分60％，发酵温度36℃，发酵36h，在此条件下，发酵产物中的活菌总数可达1.12×1010cfu/g，且每种菌的活菌数均＞109cfu/g;最佳干燥方法为冷冻干燥法，干燥后的复合菌剂总活菌数可达6.23×109cfu/g，且每种菌的活菌数均＞3×108cfu/g。结果提示，该复合益生菌制剂满足了饲用益生菌制剂的基本要求，可进一步用于猪的饲养试验，以确定其饲用效果。
　　3.饲喂益生菌制剂对生长猪生长性能、血清生化及免疫指标的影响。为评价研制的复合益生菌剂对生长猪的饲喂效果。采用单因素4水平3重复随机设计，将体重16.07±1.02kg的健康二元猪（大×长）母猪72头，随机分为4个组，每组3个重复，每个重复6头猪。对照组饲喂基础日粮，其它3个组分别在基础日粮中添加0.1％、0.2％和0.3％的复合益生菌制剂，试验期35天，于试验结束当天，以重复为单位，称各组猪的体质量并记录采食量以计算其生长性能，并在每个重复中随机选取2头猪，采血，用于检测血清生化及免疫指标。结果表明，随着益生菌添加剂量的增加，猪的平均日增重(average daily gain，ADG)及平均日采食量(average daily feed intake，ADFI)也不断提高，当添加剂量为0.3％时，猪的ADG和ADFI显著高于对照组（P＜0.05）;饲喂益生菌制剂0.2％和0.3％组的血清白蛋白(albumin，ALB)显著(P＜0.05)高于对照组，且以0.3％组的ALB含量最高，而各组的血清谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草转氨酶(aspartate transaminase，AST)、总蛋白(total protein，TP)、球蛋白(globulin，GLB)和尿素氮(urea nitrogen，BUN)均差异不显著(P＞0.05);各组血清免疫球蛋白M(immunoglobulin M，IgM)差异不显著（P＞0.05），但随着益生菌剂饲喂剂量的增加，血清免疫球蛋白A(immunoglobulin A，IgA)和血清免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）不断提升，其中，0.3％组猪的IgA和IgG均显著高于(P＜0.05)对照组。结果提示，该复合益生菌剂能够提高生长猪的采食量进而提高其日增重，同时可改善其免疫性能，且以0.3％的添加剂量饲喂效果最佳。
　　4.饲喂益生菌制剂对妊娠母猪生产性能及其仔猪生长性能的影响。为评价研制的复合益生菌剂对妊娠母猪和断奶仔猪的饲喂效果，采用单因素4水平6重复随机设计，将同胎次、妊娠期81～85天的健康母猪24头，随机分为4组，每组6个重复，每个重复为1头猪，对照组饲喂基础日粮，其它3个组分别在基础日粮中添加0.1％、0.2％、0.3％的复合益生菌制剂。以窝为单位，于母猪分娩时，称仔猪的出生重并记录出生产仔数及出生活仔数，于仔猪28日龄断奶时，称哺乳仔猪的断奶重，记录断奶活仔数、断奶存活率并统计其哺乳腹泻率，然后在每窝随机选取1头猪，采血，用以免疫指标的测定;随后母猪离开仔猪，留圈的24窝断奶仔猪（共227头）改饲断奶仔猪饲粮，并添加与其母猪等剂量的复合益生菌制剂28天。试验结束后，统计其腹泻率，并以窝为单位，称其体质量并记录采食量。结果表明，各组总产仔数、出生活仔数、出生活仔率、出生窝均重合出生头均重差异均不显著(P＞0.05);各组哺乳仔猪的断奶活仔数、断奶存活率、断奶体重、血清IgM及哺乳期间腹泻率差异均不显著(P＞0.05)，但其IgA和IgG随益生菌制剂添加剂量的增加而增加，其中，0.2％组猪的IgA显著高于对照组（P＜0.05），而0.3％组猪的IgA和IgG均显著高于对照组(P＜0.05);随益生菌饲喂添加剂量的增加，断奶仔猪的ADG和ADFI呈增高趋势，其料重比(feed/gain，F/D)和腹泻率呈降低趋势，当饲喂剂量达到0.2％及以上时，其ADG和ADFI显著高于对照组(P＜0.05)，腹泻率显著低于对照组(P＜0.05)。当饲喂剂量为0.3％时，其料肉比也显著低于对照组(P＜0.05)。结果提示，饲喂复合益生菌剂不影响妊娠母猪的生产性能，但可提高其哺乳仔猪的免疫能力，且能够改善断奶仔猪的生长性能，并降低其腹泻率，以0.3％的添加剂量饲喂效果最佳。