木霉内切葡聚糖酶定向进化及高活性突变体的筛选

纤维素是自然界中数量最大的可再生性资源，它的降解依赖于纤维素酶系，包括外切葡聚糖酶(EG)、内切葡聚糖酶(CBH)和β-葡萄糖苷酶的协同作用。内切葡聚糖酶EGI是纤维素酶系中的主要组份，由催化结构域、连接肽和结合结构域组成，但目前报道的酶活性较低，限制了工业应用。本研究以里氏木霉(Trichodermareesei)、拟康氏木霉(H.pseudokoningii)和长枝木霉(T.longibrachiatum)EGI基因为模板，通过DNA改组技术构建突变体库，并对酵母重组分泌的表达突变体筛选，主要结果如下：
　　 1.分别克隆了里氏木霉，拟康氏木霉和长枝木霉内切葡聚糖酶编码EGI的基因组DNA，其基因全长分别是1507bp，1566bp和1566bp，根据报道，它们均由3个外显子和2个内含子组成，分别编码459，461和461个氨基酸，编码蛋白的N端均为22aa组成的信号肽。
　　 2.采用重叠PCR法获得里氏木霉无内含子的内切葡聚糖酶基因egl，将去除信号肽的编码序列插入pYEa酵母表达载体，表达的蛋白含有分泌信号肽a；以构建含自身信号肽重组表达载体作对照。分别转化酿酒酵母，诱导后检测到，表达含a信号肽的内切葡聚糖酶的重组细胞有活性；而对照无明显活性。说明a信号肽可有效地将EGI成熟肽分泌至胞外。
　　 3.采用重叠PCR法分别获得拟康氏木霉和长枝木霉内切葡聚糖酶编码基因，构建酵母分泌表达载体，分别转化酿酒酵母，重组转化子检测到酶活。
　　 4.对3种木霉成熟肽编码序列进行DNA改组，构建突变体库，通过活性筛选获得高活性突变体，命名为New8。它在诱导培养96h达到活性最高1.97U/mL，是3种木霉的野生型EGI平均酶活的1.9倍；最适温度为50℃，最适pH为5.6，与其他3种木霉相似。SDS-PAGE电泳显示New8亚基蛋白分子量比理论分子量偏大。
　　 5.亚克隆New8egl，由1320bp组成，核苷酸序列分析表明与里氏木霉，拟康氏木霉和长枝木霉的相似度分别为94％，95％，96％，有114个重组位点和4个突变位点。New8EGI与3个原始EGI之间的同源性为95％，96％，97％。在4个突变位点中，V10A和F192L未引起New8EGI疏水性改变，G100S和S318G引起亲水性改变。蛋白质三级结构预测结果表明，突变位点S318G在催化结构域的活性中心附近。
　　 综上所述，本文克隆了里氏木霉，拟康氏木霉和长枝木霉内切葡聚糖酶基因egl；建立了木霉EGI酿酒酵母胞外分泌表达体系；并将这一体系运用于木霉egl多基因改组酵母文库的初步构建及筛选；获得一内切葡聚糖酶新基因。这一研究将为今后纤维素酶系中其它酶类(CBH、BG)的基因改造，乃至构筑高效的纤维素降解体系奠定良好的前期基础。