大鼠颅脑手术止血材料的应用及其转归

目的:制作大鼠外伤后脑出血模型，在颅内出血灶应用止血材料（可吸收明胶海绵、Surgicel）进行止血，观察止血材料在光镜下、电镜下的变化，以及应用止血材料后出血部位脑组织的病理改变，脑细胞的凋亡情况。
　　 方法:
　　 1、大鼠外伤性脑出血模型的制作
　　 Wistar大鼠72只，雌雄不限，体重300-350克，随机分为:
　　 ①对照组24只，手术后不应用止血材料仅应用棉片压迫止血；
　　 ②止血材料组48只，术后应用止血材料止血，根据手术后应用可吸收明胶海绵或Surgicel分为两个小组，每组24只。
　　 对照组、明胶海绵组、Surgicel组根据处死时间（5天、10天、15天、20天、25天、30天）各分为六个亚组。每个亚组4只。
　　 将大鼠用10％水合氯醛腹腔麻醉后，纵行切开颅项皮肤，在右侧顶骨（距矢状缝，冠状缝各5mm）处用牙科磨钻仔细打磨出一直径5mm的骨窗，保持硬膜的完整不受损。应用外科3-0带线缝合针划开硬膜，不触及皮层，暴露脑组织，硬膜出血采用沾水棉片压迫止血。应用显微取瘤镊夹取大脑皮层范围:2mm×2mm×1mm，造成外伤出血模型，按照分组应用棉片压迫、可吸收明胶海绵、Surgicel进行有效止血。完全止血后缝合伤口。术后大鼠正常进食，不能进食者给糖水灌胃。于5天，10天，15天，20天，25天，30天时分别处死各组4只大鼠。
　　 2、光镜下观察应用吸收性明胶海绵、Surgicel及对照组的大鼠脑组织H-E染色组织切片
　　 于5天，10天，15天，20天，25天，30天时分别处死各组2只大鼠，经左心室-升主动脉插管，快速灌注生理盐水150ml、4％多聚甲醛300ml（4℃，0.1M的PBS配制，PH7.4）先快后慢灌注2h，待大鼠四肢僵直后断头取脑。用4％多聚甲醛固定24小时以上。切取应用止血材料部位的脑组织，常规酒精梯度脱水、透明、石蜡包埋，连续切片5μm。做苏木精-伊红(H-E)染色。采集图像。
　　 3、透射电镜及扫描电镜下观察应用吸收性明胶海绵、Surgicel及对照组的大鼠颅脑损伤切片
　　 于5天，10天，15天，20天，25天，30天时分别处死各组2只大鼠，经左心室-升主动脉插管，快速灌注生理盐水150ml、4％多聚甲醛300ml（4℃，0.1M的PBS配制，PH7.4）先快后慢灌注2h，断头取脑，切取应用止血材料部位的大鼠脑组织，4％戊二醛固定24h，扫描电镜标本制备为:3mm×3mm×1mm，1％锇酸固定1h，经酒精梯度脱水，真空干燥，喷金镀膜后采集图像。透射电镜标本制备为1mm×1mm×1mm，1％锇酸固定1h，经硬化标本制备，超薄切片，溶液成膜，复型成膜后采集图像。
　　 4、观察应用吸收性明胶海绵、Surgicel及空白组的脑组织细胞凋亡改变
　　 每组随机选取蜡块固定的一个标本，经过切片，脱水、水合，细胞通透，TUNEL反应液作用，converter-POD作用，与底物DBA反应显色后在高倍镜下随机选取三个视野计数并拍照。
　　 结果:
　　 1、光镜下创伤脑组织的病理改变与止血材料的吸收与转归
　　 在5d、10d、15d的脑组织切片H-E染色切片显示:三个实验组的出血灶炎症反应均明显，周围存在坏死破碎脑组织。单核细胞浸润，红细胞弥漫性存在于破碎的脑组织、止血材料间隙中。随着时间的迁移，炎症反应逐渐减轻，单核细胞与红细胞的数量减少。对照组可见神经细胞水肿，大量单核细胞浸润，局部可见红细胞变形破碎。红细胞破碎，释放的血红蛋白被氧化变成黄色。吸收性明胶海绵与脑组织的贴附性较Surgicel差，炎症反应较重，并且占位空间也较大。实验证实:Surgicel在与脑组织的组织相容性方面优于可吸收明胶海绵。
　　 2、电镜下创伤脑组织的病理改变与止血材料的吸收与转归
　　 2.1、扫描电镜下创伤脑组织的病理改变与止血材料的吸收与转归
　　 出血部位脑组织可见明显的脑水肿、软化灶。水肿灶、软化灶与正常部位脑组织界限较为明显。空白组与Surgicel组在25天的标本可见水肿程度较之前的标本减轻，而吸收性明胶海绵在25天的标本仍存在明显的水肿。对照组可见脑组织破碎，出血灶脑组织参差不齐，脑水肿。少数出血灶仍可见未变形的红细胞。在同一时间点可吸收明胶海绵仍可见明显的颅内占位效应。Surgicel与脑组织的贴附性优于比吸收性明胶海绵。随着时间的进展脑水肿逐渐减轻。
　　 2.2、透射电镜下创伤脑组织的病理改变与止血材料的吸收与转归
　　 术后5d脑组织的吞噬细胞吞噬大量变性坏死的神经纤维。术后15d与25d的神经元在不同组别有所不同。对照组以神经元细胞固缩、线粒体肿胀、高尔基体扩张、神经纤维水肿为主。吸收性明胶海绵组中神经元细胞肿胀较轻，部分线粒体空泡化、线粒体肿胀、高尔基体扩张。Surgicel组神经元细胞胞浆水肿、神经元突起水肿、线粒体肿胀、高尔基体扩张。
　　 3、应用吸收性明胶海绵、Surgicel以及对照组实验的脑组织凋亡改变阳性凋亡细胞在细胞膜上和胞质中均出现棕黄色颗粒，结构清晰，着色明显高于背景，阴性对照无棕色反应，正常细胞或繁殖细胞核为蓝色。测定凋亡的神经细胞阳性细胞数分级和阳性细胞显色强度分级，计算凋亡细胞的免疫组化评分（IHS值）进行统计分析，实验数据表明:
　　 ①止血方式不同时，各组IHS值存在明显差异(P＜0.05)，具有统计学意义，且任两组相互比较均存在差异(P＜0.05)。
　　 ②当时间作为实验的影响因素，各时间点的IHS值存在差异(P＜0.05)，任两组进行比较时，除20d与25d标本的IHS值无差异外，其余各时间点的IHS值均存在差异（P＜0.05）。
　　 ③当时间跟处理因素综合考虑时，Surgicel止血后10d凋亡指数最高，空白组25天凋亡指数最低。
　　 ④并且时间与止血方式存在交互作用（P＜0.05）。
　　 结论:
　　 1、作为神经外科止血材料，Surgicel的组织相容性优于吸收性明胶海绵。
　　 2、应用止血材料会对细胞凋亡产生不同程度的影响。
　　 3、在保证止血效果的前提下，应尽量减少止血材料的应用。