煤污病病原真菌比较和进化基因组学及外寄生机制研究

煤污病是一种世界性的植物真菌病害，普遍发生于温暖湿润的国家和地区，能够在苹果、梨等果实以及毛竹、紫薇等观赏植物的表面形成黑色的污斑和污点，导致其商品价值大幅下降，造成严重的经济损失。煤污病菌种类多样，大部分归属于座囊菌纲(Dothideomycetes)的多个科、属。它们主要由植物寄生性致病菌演化而来，但通常都只定殖于寄主植物表皮层而不侵入寄主内部，因而被认为是特殊的植物病原真菌类群--"附生菌(epiphyte)"。近年来，国内外对煤污病菌的分类学、生物地理学、流行学和药剂防治等方面进行了系统研究，但对于其在寄丰表面严苛环境下（营养不足、干旱、强紫外线等）的适应机制仍不清楚。
　　本研究通过全基因组测序、比较基因组和转录组分析，并结合组织学技术揭示了煤污病病原真菌的致病机理和演化模式，主要得到以下结果:
　　果生月盾霉（Peltaster fructicola），一种常见的煤污病菌，基因组测序大小为18.14Mb，共预测出8，334个蛋白编码基因，重复序列比率为0.42％。与其它真菌相比，果生月盾霉属于基因组大小、基因数目和重复序列比率均较少的物种。系统发育基因组学显示，果生月盾霉与半活体营养型小麦叶枯菌（Zymoseptoria tritici）的亲缘关系相对较近，但前者在进化中比后者丢失了更多的基因家族（1，019个vs.525个）却获得了较少的基因家族（58个vs.190个）;且孤儿基因在果生月盾霉中所产生的数量（1，485个）也远少于小麦叶枯菌（2，972个）。因此，果生月盾霉应是经历了一种收缩性的演化过程，即固有的基因发生大量遗失而新基因严重缺乏。推测果生月盾霉基因组结构这种紧缩的特性可能与其极端的生存环境有关。
　　生物信息学鉴定发现，果生月盾霉中仅含有107个外分泌蛋白编码基因，远少于除酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）外的其它参与比较的腐生、共生和寄生真菌（166～991个），其中作为候选效应蛋白的小分泌蛋白更是仅筛选出了12个，比上述所有真菌（16～343个）都要少。这表明果生月盾霉缺少由分泌蛋白，尤其是效应蛋白所介导的病原与寄主植物间互作。果生月盾霉中能够编码次级代谢产物合成核心酶的基因只有15个，少于包括小麦叶枯菌（28个）在内的绝大多数植物病原真菌（18～82个），说明果生月盾霉可能缺乏侵染寄主植物所需的次级代谢物，如真菌毒素。同小麦叶枯菌中注释到的68个植物细胞壁降解酶相比，果生月盾霉（24个）中主要缺少了β-1，4-内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-1，4-内切木聚糖酶、β-1，4-内切甘露聚糖酶、果胶甲基酯酶、果胶酸盐裂解酶和内切鼠李半乳糖醛酸酶。这些酶类都会参与植物细胞壁重要成分（葡聚糖、木葡聚糖、木聚糖、半乳甘露聚糖、同聚半乳糖醛酸和鼠李半乳糖醛酸I）主链的降解，使得果生月盾霉无法突破植物表皮细胞壁。此外，转录组分析也显示，以上三类植物致病相关基因在果生月盾霉侵染寄主过程中大多是低表达甚至不表达的。同样属于植物细胞壁降解酶的角质酶编码基因被较为完整的保留并具有相当的转录活性，进一步证明了该煤污病菌的外致病性。为了适应寄主表面的极端环境，属于次级代谢产物的DHN-黑色素的合成相关基因也被保留。
　　通过对被侵染的苹果表皮进行组织学观察发现，果生月盾霉在寄主表面扩展时不仅能够分解植物表层蜡质，还能在其类菌核体下方降解并穿透部分真角质层，这种定殖策略无疑有利于该病原菌在寄主植物表皮上的附着并从其中获取所需的营养物质。因此笔者提出，果生月盾霉作为一种能够全程在寄主植物体外进行寄生生长的病原菌应被定义为"外寄生菌(ectophyte)"，而非是营腐生生活的"附生菌"。
　　综上所述，果生月盾霉在由植物穿透型病原真菌向煤污病菌演化的过程中，基因组发生显著收缩，放弃了大量致病性相关的基因，却保留了一些与寄主植物表面定殖有关的功能，最终形成了一种独特的植物外寄生营养模式。而这种演化方式可能有助于病原菌逃避寄主的专化性和免疫防卫反应，进而适应迅速改变的生态环境。
　　为了明确果生月盾霉的基因组演化方式在整个煤污病菌类群中的普遍性，笔者对另外三种煤污病菌--苹果小叠孢(Microcyclosporella mali)、角状平脐疣孢（Zasmidium angulare）和仁果叠孢（Microcyclospora pomicola）的基因组进行了测序，并与它们各自的近缘植物穿透型寄生菌--桉树叶斑病菌（Mycosphaerella madeirae）、柑橘腻斑病菌（Zasmidium citri）和桉树叶斑病菌（Teratosphaeria nubilosa）进行了比较基因组分析。结果显示，这三种煤污病菌在基因组大小(26.7Mb vs.32.2Mb;36.2Mb vs.42.9Mb;22.4Mb vs.27.1Mb)、基因数量(11，572个vs.14，017个;14，946个vs.17，275个;9，169个vs.10，998个)以及重复序列比率(1.57％vs.6.09％;3.60％vs.8.35％;1.95％vs.7.88％)等方面均小于穿透型病原菌，表明它们的基因组结构同样具有紧缩特性。而且，相比于穿透型病原菌，这三种煤污病菌在外分泌蛋白（488个vs.633个;887个vs.1，142个;339个vs.484个）、植物细胞壁降解酶（75个vs.98个;140个vs.160个;34个vs.75个）、次级代谢产物合成核心酶（29个vs.47个;34个vs.49个;19个vs.23个）和MFS转运蛋白（296个vs.396个;511个vs.596个;195个vs.242个）等植物致病因子的数量上也一致表现出了缩减，这意味着其侵入能力的减弱。因此，笔者认为煤污病菌的基因组均呈现出了收缩演化的趋势，只不过与果生月盾霉比起来，这三种煤污病菌的基因组收缩程度相对较小。