BCL-2,NF-КB,血管紧张素ΙΙ-Ι受体在大鼠非酒精性脂肪肝病中的作用及其机制研究

目的：非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)近年来发病率逐年增高,是一种严重威胁着人类健康的常见疾病,是在患者无过量饮酒史的情况下,发生的与酒精性肝病(ALD)相似的肝脏病理学变化,其病理生理改变主要是肝细胞发生炎症、坏死和凋亡,病程逐渐向脂肪性肝炎、肝纤维化,肝硬化发展。现有研究认为非酒精性肝病,是一种与遗传基因易感性以及胰岛素抵抗密切相关的应激性代谢性肝损伤。本研究通过建立非酒精性脂肪性肝病大鼠模型,随着其病变进展在不同时间点观察肝细胞凋亡,炎症,纤维化,以及相关的蛋白BCL-2、NF-KB、血管紧素Ⅱ-1 受体的表达情况,从而探讨以上三种相关蛋白在非酒精性肝病中的作用及其机制,并研究通过抑制NF-KB表达后,所致的肝脏病理形态变化及 BCL-2,血管紧素ΙΙ-1 受体的表达改变情况,为研究NAFLD发病机制及治疗方案提供新的研究佐证。方法：健康成年雄性 Spague-Dawlay(SD)大鼠42只按随机表为三组3组：正常组18只(普通饲料喂养),模型组18只(高脂饮食喂养),干预组6只(高脂饮食饲养10周后PDTC腹腔注射4周),分别于6,10,14周末处死各组大鼠6只,每组大鼠处死后以心脏采血,并测定各组大鼠血脂和转氨酶值,取肝组织标本测定肝指数(处死大鼠开腹后迅速取出肝脏,称肝湿重,(计算方法：肝湿质量/体质量×100%),固定并切片后苏木精-伊红(HE)染色观察肝组织病理改变(脂肪变,炎症,纤维化等)；采用 TUNEL 法测肝细胞凋亡百分数法测肝细胞凋亡百分数；免疫组织化学法检测Bcl-2,NF-KB在肝组织中表达情况；RT-PCR法(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)检测肝脏血管紧张素二-1受体(AT1R)的表达。计量资料用均数±标准差(xˉ±S)表示,P<0.05有统计学意义。不同时间段正常组与模型组组间比较,模型组与正常组组间比较,14 周干预组,模型组,正常组三组比较采用方差分析,并进行方差齐性检验,齐者采用单因素方差分析。结果：进行实验的42只大鼠全部存活,都进入结果进行分析。⑴随着时间的延长,6 周末及 10 周末均成功构建非酒精性脂肪肝及非酒精性肝炎模型,14 周末模型组出现 4 只大鼠肝纤维化,干预组出现 1只大鼠纤维化。(2)6、10、14周模型组大鼠在肝湿变数、血脂、血清转氨酶水平等方面逐步增高,肝组织脂肪变、炎症程度逐渐加重,后期出现纤维化表现；而干预组在上述方面亦有增高。(3)HE染色提示模型组6、10、14周动物肝组织出现脂肪变性并随造模时间的延长而加重,都明显高于正常组(P<0.01)；10组大鼠肝脏可见少许气球样肝细胞及程度不等的肝细胞坏死和小叶内炎症、腺泡内散在个别点灶状坏死,部分可见点灶状坏死增多,门管区轻中度炎症。模型组6,10周大鼠未见肝组织纤维化,但造模14周及干预组14周分别有4/6、1/6只大鼠出现肝细胞窦周纤维化。6,10,14周模型组大鼠的肝脏活动度积分均高于正常组(P<0.01),14周末时,干预组肝组织的活动度积分低于模型组(P<0.05)。(4)肝细胞凋亡百分数随着造模时间的延长而增加,模型组6周、10周、14周分别为11.15±0.82、16.19±1.23、19.23 ±2.31,正常组6周、10周、14周分别为1.11±0.15、1.26±0.11、1.15±0.20,其差异具有统计学意义(P<0.01)；⑷蛋白免疫组化显示：BCL-2蛋白在模型组的细胞浆,细胞膜呈棕色表达,并随着造模时间的延长,染色程度加深,面积增大；Bcl-2 在正常组的表达均为散在弱阳性,模型组组6、10、14周阳性细胞数渐增加,干预组Bcl-2表达低于 14 周模型组(P<0.05),NF-КB 细胞染色呈黄色或综黄色为阳性,定位于细胞质和(或)细胞核,模型组6、10、14周大鼠肝细胞内可见 NF-КB明显活化,相对于同时间段正常组表达之间差别有明显统计学意义(P<0.01),而且随造模时间延长,其表达随之增多,差异有统计学意义(P<0.05),14 周干预组表达受较 14 周造模组受到抑制,但是较正常组比较其表达也是明显增高的(P<0.05)。(5)RT-PCR法检测肝脏 AT1RmRNA 显示：AT1RmRNA 表达量在造模组中随着造模时间的延长,表达量逐渐增加,且每两组模型组组间都存在统计学差异(p<0.05)造模组AT1RmRNA表达量均明显高于同时间段正常组(p<0.01),14周末,模型组,正常组,干预组三组间AT1RmRNA表达量存在差异(p<0.05)。结论：1.在非酒精性脂肪性肝病大鼠模型中,随着肝脏病变的加重,其细胞凋亡,炎症及纤维化愈加明显,其表现为Bcl-2,NF-KB,血管紧素ΙΙ-1受体的表达增加。2 在NAFLD发生发展过程中对NF-KB进行抑制调控后,NAFLD肝细胞炎症,纤维化也受到抑制,同时也出现 Bcl-2,血管紧素ΙΙ-1 受体表达的降低,NF-KB可能通过调节Bcl-2,血管紧素ΙΙ-1受体,的表达在NAFLD病程中发挥作用。