中国野生毛葡萄VqRSGT基因的遗传转化与功能研究

葡萄是世界四大果树之一，在世界范围内有着广泛的栽培与种植，目前主栽的酿酒及鲜食品种主要为欧洲葡萄（Vitis vinifera.L），其品质优良，但大多数抗病性较差，尤其不抗白粉病。白藜芦醇作为一种植保素，参与调控葡萄响应白粉菌侵染的过程并发挥抗病效用，因此研究白藜芦醇代谢相关基因的功能将有助于更深入了解葡萄的抗病机理。中国是葡萄起源中心之一，具有丰富的野生葡萄资源和抗病葡萄品种，前期研究表明中国野生毛葡萄丹凤-2（Vitis.quinquangularis Rehd.Dangfeng-2）的白藜芦醇含量较高，且对白粉病有着较强抗性。本研究以中国野生毛葡萄丹凤-2为材料，通过同源克隆获得白藜芦醇糖基转移酶基因编码区序列，构建植物过表达载体，利用农杆菌介导法遗传转化欧洲葡萄无核白和红地球，对基因表达特性及转基因葡萄对白粉菌的响应进行了研究，取得主要结果如下:
　　1.比较了4种欧洲葡萄霞多丽（V.vinifera cv.Chardonnay）、黑比诺(V.vinifera cv.Pinot Noir)、赤霞珠（V.vinifera cv.Cabernet Sauvignon）和红地球(V.vinifera cv.Red Globe)的3种外植体（雄蕊、子房和小花蕾）在3种诱导培养基（PIV、MS1和PN）上胚性愈伤组织的诱导率。结果表明最适合胚性愈伤组织诱导的外植体为花粉小孢子处于单核靠边期的小花蕾，总体上MS1和PIV的诱导效率较好。针对不同基因型的葡萄，其适合的诱导培养基成分也不相同，PIV培养基更适合霞多丽和黑比诺胚性愈伤组织的诱导;MS1培养基更适合赤霞珠胚性愈伤组织的诱导;PN培养基更适合红地球胚性愈伤组织的诱导。
　　2.比较了3种欧洲葡萄无核白（V.vinifera cv.Thompson Seedless）、红地球和赤霞珠以单芽茎段为外植体在3组培养基上的器官发生诱导不定芽的再生。以激素组合分别为1.0mg/L BAP、1.0mg/L BAP+0.02mg/L NAA、2.0mg/L BAP+0.02mg/L NAA和4.0mg/L BAP+0.02mg/L NAA的系列培养基，相较于添加0.1mg/L2，4-D或0.1mg/L TDZ的系列培养基更适合无核白、红地球和赤霞珠葡萄单芽茎段逐步诱导出分生愈伤组织。
　　3.优化了无核白葡萄愈伤组织瞬时转化体系，确立了重悬液pH5.1，菌液浓度OD6001.0，真空渗透20min条件下，转化效率最优。利用优化的瞬时转化体系瞬时转化无核白葡萄的愈伤组织、茎、根、卷须、幼叶、成龄叶和老叶，发现在不同器官中转化效率存在显著差异，其中以愈伤组织为受体的转化效率显著高于其他器官（GUS酶活力为65231.99±3339.29pmol/min/mg），而且愈伤组织的GUS组织化学染色最深，以叶片为受体的转化效率则最低。
　　4.同源克隆获得中国野生毛葡萄白藜芦醇糖基转移酶VqRSGT的开放阅读框序列，经预测其定位于葡萄第三号染色体，CDS为1440bp，编码479个氨基酸，与欧洲葡萄黑比诺的VvRSGT氨基酸序列对比仅有一个氨基酸的不同。亚细胞定位结果表明VqRSGT定位在细胞质及细胞核中。
　　5.通过PCR及Western Bloot检测确定获得4个株系的转VqRSGT基因的无核白葡萄和3个株系的转VqRSGT基因的红地球葡萄。RT-PCR结果显示外源VqRSGT的表达不同程度的提高了苯丙氨酸代谢途径中其上游的相关基因的表达量;对野生型及转基因株系进行压片法接种白粉菌24，48，72和168h后，统计野生型和转基因株系叶片上孢子数及菌丝数，其数据结果表明转基因株系对白粉菌的抗性并不显著低于野生型。