槲皮素/HO-1/胆红素系统对大鼠原代肝细胞酒精性损伤的保护作用

研究背景：
　　 随着人们生活水平的提高和生活方式的改变，酒精性肝病(alcoholic liverdisease，ALD)的发病率呈逐渐增高之势，成为仅次于病毒性肝炎的第二大类肝病，其预防和治疗也一直是世界性的重要公共卫生问题。ALD的发病机制比较复杂，其中以氧化损伤与炎性应激学说备受关注。近来越来越多研究发现，槲皮素作为食物来源广泛的黄酮类化合物，具有显著的抗氧化、抗炎、抗凋亡等生物学效应，对ALD 也具有明显的保护效应。进一步的研究表明，槲皮素对ALD的保护作用与其通过诱导肝脏I 型血红素氧合酶(heme oxygenase-1，HO-1)而进一步放大其抗氧化活性有关。
　　 然而，作为HO-1 催化血红素分解的代谢产物之一的胆红素，曾长期被认为是机体有毒的代谢产物。只是近年来，随着研究的深入，学者们才发现正常生理浓度的胆红素也具有良好的抗氧化、抗炎、抗凋亡等生物活性。但胆红素是否参与或介导HO-1 对肝细胞酒精性损伤的保护作用，目前尚无直接相关的研究报道。
　　 因此，探讨HO-1 代谢产物胆红素对酒精所致肝细胞氧化损伤与炎性应激的保护作用，不仅可进一步完善槲皮素/HO-1 拮抗酒精性肝损伤的相关作用机制，还可更好地拓展人们对胆红素的认识。
　　 目的：
　　 1.探讨槲皮素诱导HO-1 生成的胆红素对乙醇诱导的肝细胞氧化损伤的潜在保护作用及其剂量效应关系，并探讨胆红素对乙醇诱导氧化应激所触发的细胞凋亡是否具有拮抗效应；
　　 2.分析胆红素对肝细胞氧化、炎性双重应激的潜在保护作用。
　　 方法：
　　 1．二步胶原酶灌注消化分离培养大鼠原代肝细胞，给以无水乙醇(200mmol/L，24h)诱导肝细胞氧化损伤，同时单独或联合给以槲皮素(100 μmol/L)、Hemin(血红素，HO-1 诱导剂，20 μmol/L)、锌原卟啉-IX(ZnPP-IX，HO-1 抑制剂，10 μmol/L)及不同剂量的外源性胆红素(2、10、25、100 μmol/L)，观察细胞AST、LDH 酶的漏出、SOD 酶活性、GSH 水平、脂质过氧化产物MDA与ROS的产生及内源性直接胆红素水平，并检测细胞线粒体膜电位、细胞凋亡率的变化。
　　 2．在大鼠原代肝细胞经乙醇孵育(200 mmol/L)的同时，加入外源性的炎症因子(TNF-α<5ng/ml>+IL-6＜2 ng/ml>)诱导细胞氧化与炎性双重应激，再加入胆红素干预，观察上述氧化应激相关指标的变化，分析胆红素对肝细胞酒精性氧化损伤基础上叠加炎性应激时的保护作用。
　　 结果：
　　 1．槲皮素对乙醇诱导的肝细胞AST与LDH 酶的漏出、细胞GSH与SOD的消耗、MDA与ROS的产生对均有明显的抑制作用，并且提高了内源性胆红素水平；血红素表现了与槲皮素类似的效应；而HO-1 抑制剂ZnPP-IX 则明显抑制了槲皮素的上述保护效应。
　　 2．中剂量的外源性胆红素(25μmol/L、10 μmol/L)对乙醇诱导的肝细胞AST与LDH 酶的漏出、GSH与SOD的消耗及MDA与ROS的产生也有明显的抑制作用，而低剂量的胆红素(2 μmol/L)则无明显的保护作用，高剂量的胆红素(100μmol/L)不仅本身表现出一定的细胞毒性，而且加重了乙醇的细胞毒性。
　　 3．槲皮素有效拮抗乙醇诱导的细胞线粒体膜电位下降、并降低了细胞凋亡率，血红素表现出与槲皮素类似的效应，而ZnPP-IX 则明显抑制了槲皮素的上述保护效应。细胞经乙醇孵育的同时给以外源性胆红素(25μmol/L)，也有效维持了线粒体膜电位水平且降低了细胞凋亡率。
　　 4．外源性炎症因子与乙醇共同处理肝细胞时，加重了乙醇诱导的AST与LDH酶的漏出、GSH与SOD的消耗及MDA与ROS的产生。氧化、炎性双重应激时，外源性胆红素(25μmol/L)对细胞氧化应激相关指标的变化具有明显的抑制作用。
　　 结论：
　　 槲皮素诱导HO-1 可抑制肝细胞酒精性氧化损伤和炎性应激，并且还能有效拮抗酒精所致的线粒体膜电位下降和细胞凋亡。此外，作为HO-1的催化代谢产物，胆红素还有可能介导了HO-1的上述保护作用。