阳离子抗菌肽G13的原核表达和真核表达系统的构建

颗粒裂解肽(Granulysin)是阳离子抗菌肽的一种，来自细胞毒性T淋巴细胞和自然杀伤细胞。阳离子抗菌肽G13是Granulysin中，含19个氨基酸残基肽段，含有α-螺旋结构及loop结构，对细菌具有抑菌活性而对动物细胞无毒，具有重要的研究价值。抗菌肽原核表达主要采用融合表达技术抑制抗菌肽的毒性。但融合头一般在重组蛋白中比例较高，导致了抗菌肽的实际表达产量较低。本实验以pThiohisA-G13载体中的融合头为基础，设计了一对反向引物，采用反向PCR方法去除载体了融合头中87个氨基酸残基，构建了pThiohisA-G13-A质粒，同时获得了高效表达，将抗菌肽的实际产量提高了2.3倍，具有广泛的应用前景。融合头切割一直是抗菌肽融合表达的一个突出问题。传统的酶法成本极高，化学法中，溴化氰含有剧毒，难以广泛使用。
　　本实验利用天冬氨酸-脯氨酸之间的肽键在低PH下不稳定的特性，在融合头与抗菌肽之间添加酸水解切割位点，构建了pThiohisA-G13-C质粒，获得了重组蛋白的可溶性表达。同时研究了酸水解反应条件，成功地切割了阳离子抗菌肽G13结构域，并通过阳离子交换获得了纯化的阳离子抗菌肽G13结构域，琼脂糖扩散法检测了重组阳离子抗菌肽G13对大肠杆菌DH5α抑菌活性。为抗菌肽在低成本大规模生产中的应用奠定了基础。本实验同时对抗菌肽真核表达进行了研究，成功地对阳离子抗菌肽G13在酿酒酵母中的表达条件进行了优化，获得了具有活性的阳离子抗菌肽G13，从而建立了一套稳定表达的方法。为后续的纯化和类似抗菌肽的表达提供了依据。本实验还成功构建了酿酒酵母pYES2-α-L50A表达载体，并获得了有活性的肠球菌素L50A，为后续的表达研究工作奠定了基础，同时初步证明了酿酒酵母真核表达系统用于表达多种抗菌物质的可能性。