脉冲电场对大肠杆菌与酿酒酵母细胞结构与机能影响研究

脉冲电场(pulsed electric field，PEF)处理技术是近年来液态食品灭菌领域的研究热点之一。本论文采用连续的PEF处理系统，以ATCC25922大肠杆菌和CICC1308酿酒酵母为处理对象，对PEF灭菌效果和效果优化以及灭菌机理开展了系统的实验研究，主要研究结果如下： 随电场强度(5～30kV/cm)和处理时间(133～266ms)增加，PEF对大肠杆菌和酿酒酵母杀灭效果提高，且酿酒酵母比大肠杆菌容易杀灭。选取最能显著影响灭菌效果的电场强度和处理时间为变量因素，以大肠杆菌为处理对象，进行了响应面(RSM)实验设计并通过实验结果得出了关于电场强度和处理时间对灭菌效果影响的二次方程，得到了大肠杆菌在本处理系统中的最佳杀灭条件：电场强度33.0kV/cm，处理时间为299.7ms，该条件处理可使8.3个对数级的活菌杀灭。 研究PEF对微生物细胞膜的影响时，采用紫外吸收光谱法测得微生物胞外紫外吸收物质(核酸、蛋白质、游离芳香族氨基酸)的含量随电场强度的增大和时间的延长而增大，直至趋于平衡，该结果表明PEF提高了微生物细胞膜的通透性。5kV/cm的场强处理对大肠杆菌和酿酒酵母几乎没有明显致死效果，却能使微生物细胞膜外紫外吸收物质含量显著增加，由此说明5kV/cm能够导致细胞膜通透性的明显增加，这种通透性的改变是可逆的；电场强度大于15kV/cm后，PEF对大肠杆菌和酿酒酵母细胞膜通透性的改变不可逆，大量细胞开始死亡。比较不同生理时期的酿酒酵母在PEF作用下细胞膜外紫外吸收物质的变化，发现稳定期细胞的变化最大，延迟期细胞的变化最小。 采用原子吸收光谱法研究了PEF对细胞膜离子通透性的影响，测得大肠杆菌受PEF作用后，胞外K<'+>浓度升高，Ca<'2+>离子浓度减少。此现象揭示了PEF作用降低了膜内外原有的离子浓度差，提高了膜的通透性，以致破坏了膜原有的电势，加速了细胞的死亡。 采用荧光偏振光谱法检测了酿酒酵母受：PEF作用后细胞膜的流动性变化情况，发现膜流动性随电场强度的增大和作用时间的延长而下降，且细胞膜的流动性降低与细胞膜的通透性升高成正相关，与细胞的存活率成负相关，表明膜流动性下降与细胞存活率也存在着一定的联系。 使用丙二醛(MDA)试剂盒检测PEF对大肠杆菌和酿酒酵母的膜脂过氧化作用，发现电场强度大于10kV/cm时均可使两者细胞膜的MDA含量显著升高，并且随处理时间延长MDA含量升高，结果证明PEF导致了微生物细胞膜的损伤作用。 通过ERIC-PCR指纹图谱分析了PEF处理和巴氏灭菌法对大肠杆菌和酿酒酵母前后的DNA变化。对于大肠杆菌来说，电场强度≥20kV/cm可导致大分子的核酸片断发生降解成小分子核酸。在指纹图谱上表现大分子条带的消失和小分子条带的增加。对于酿酒酵母来说，电场强度≥10kV/cm可导致核酸片断的降解。巴氏灭菌对酿酒酵母和大肠杆菌核酸的影响不大，在DNA指纹图谱中表现为与未经处理的指纹图谱一样，此结果说明了强烈的PEF条件可导致微生物DNA分子降解。 PEF处理酿酒酵母后，在电场强度大于20kV/cm，胞内和胞外的蛋白质含量均减小，通过高效液相色谱仪测得细胞内和胞外的游离氨基酸增加显著，36kV/cm，133ms使胞外游离氨基酸含量由0.586mg/100mL显著增加至21.42mg/100mL，由此判断蛋白质在PEF作用下发生了降解。 采用美蓝活体染色法观察到经过PEF处理的大多数酿酒酵母细胞形状由原来的椭圆状变成瘦小的杆状。原子力显微镜观察发现处理前的酿酒酵母细胞表面光滑，体积饱满。处理后的酿酒酵母细胞发现空洞，有内容物流出，细胞体积缩小或变塌陷。大肠杆菌细胞经PEF处理后，细胞的杆状变得不规则，细胞膜表面变得粗糙，且上面有黏附颗粒，推测是细胞内部流出来的物质。