乙醇改变骨髓间充质干细胞神经肽的表达

现如今,患有酒精性股骨头坏死疾病的患者人群越来越多,严重困扰了人们的生活,但其致病的机理尚未清楚,而且到目前为止,还未找到任何一种能够有效预防酒精性股骨头坏死的方法。其严重影响了人们的身心健康,降低了生活质量。股骨头缺血坏死是指股骨头的血运不良最终导致骨细胞及组织的不断死亡和修复,从而使股骨头内部结构发生改变,而后塌陷,最终导致关节活动功能发生障碍。自17世纪有学者提出此病至今,许多学者先后提出了一系列学说,但还没有能够完整合理说明发病机制的学说。骨髓间充质干细胞是一类能够向成骨细胞方向以及其它细胞方向分化的干细胞,骨髓中存在一类神经肽类物质,这类物质对成骨或血管的分化有诱导作用,从而参与到骨组织细胞的代谢过程中,并发挥着重要的作用。到目前为止,乙醇对人骨髓间充质干细胞中神经肽表达影响,这方面在国内外还没有报道。
　　 目的:
　　 利用体外细胞学实验,观察乙醇对人骨髓间充质干细胞降钙素基因相关肽受体、P物质受体、过氧化物酶体增殖子活化受体γmRNA及Runx2mRNA表达的影响,进一步探讨酒精性股骨头缺血坏死的发病机制。
　　 材料与方法:
　　 在招募的10名年龄平均在57.5(54-62)岁的健康志愿者中抽取骨髓标本,其中有6名男性志愿者,4名女性。
　　 利用密度梯度离心与贴壁分离相结合的方法分离纯化细胞,使用无菌注射器抽取10 mL髂骨骨髓后,快速注入装有肝素钠的无菌管内并摇匀,取等体积的Ficoll淋巴细胞分离液,将标本缓慢铺上,离心后中间的白膜层则是BMSCs细胞层,轻轻将其抽出,加入PBS混匀,离心后弃去上清,加入培养基,分装到细胞培养瓶中,在培养箱中培养,第3 d后首次换液,根据培养液的颜色及细胞生长情况2d-3d换液,定期观察细胞。利用胰酶消化传代,免疫化学染色鉴定原代细胞。取6孔培养板若干,将2代细胞传代接种到板上培养,当孔内的细胞铺满板孔80％左右时,通过每4个样本一组将细胞随机分为实验组与对照组。培养基加入乙醇维持浓度在0.09 mol/L为实验组,正常培养的则是对照组。通过Trizol法在使用乙醇干预的第11d提取RNA,并且检验RNA纯度和完整性。逆转录合成cDNA,而后通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测以及PCR产物琼脂糖凝胶电泳,主要观察实验组与对照组细胞CGRP受体、P物质受体、PPAR-γ,、Runx2 mRNA表达。
　　 结果与结论:
　　 培养11d后,实验组降钙素基因相关肽受体、P物质受体、Runx2 mRNA表达较对照组明显降低(P<0.01),过氧化物酶体增殖子活化受体γmRNA水平较对照组明显增高(P<0.01)。表明乙醇改变了骨髓间充质干细胞中神经肽类物质的表达,减弱了其向成骨细胞方向分化。