缺氧环境中长链非编码RNA HOTTIP促进肝癌细胞发生上皮间质转化的分子机制研究

目的：癌症死亡的原因主要是癌症被诊断时已经处在中晚期，即使通过手术，放疗，化疗或免疫治疗后，肿瘤容易复发和转移。肝癌在中国的发病率和死亡率就特别高，病因非常复杂，常见由是于HBV/HCV感染，黄曲霉素，酒精，肝硬化等原因。目前临床上没有特别好的治疗手段，而且治疗后容易转移和复发。肿瘤的发生发展依赖于肿瘤的微环境，研究表明，缺氧微环境是肿瘤发生发展过程中最常见最重要的微环境之一，将肿瘤的代谢方式从三羧酸循环转变为糖酵解途径，通过 HIF等重要的转录因子和其他重要基因激活相应的通路，从而促进肿瘤的增殖和转移。肝癌在发生发展过程中存在明显的缺氧现象，特别是通过动脉化疗栓塞手术治疗后，会出现非常明显的缺氧情况，将会导致肿瘤的复发和转移，临床治疗效果差。随着二代测序技术大规模的应用，大量的非编码RNA被发现，包括：miRNA、lncRNA、circularRNA、snRNA等，研究发现这些非编码RNA对肿瘤的发生发展有着重要的作用。研究表明长链非编码RNA HOTTIP在肝癌临床标本中高表达，与肝癌的转移正相关，与肝癌的预后负相关，在肝癌的发生发展中发挥重要的功能，但其促进肿瘤转移的具体机制尚不清楚。因此本研究主要集中在缺氧的微环境下，长链非编码RNA HOTTIP促进肝癌细胞转移的分子机制研究。
　　方法：1.探究缺氧环境下，缺氧诱导因子 HIF-1α与长链非编码 RNA HOTTIP之间的相互调节作用。向诱导罐充入低氧混合气体（5%CO2,1%O2，94%N2）,模拟肿瘤的缺氧微环境。敲低和过表达HIF-1α来研究HIF-1α对HOTTIP的调节作用；再采用荧光报告基因实验来研究 HIF-1α是否作为转录因子通过转录调控 HOTTIP的表达。反过来研究HOTTIP对HIF-1α调节作用及机制，研究两者是否形成正反馈调节。
　　2.探究缺氧环境下，长链非编码RNA HOTTIP对肝癌细胞发生上皮间质转化的影响以及哪个分子介导此过程。缺氧诱导模型来研究肝癌细胞在缺氧微环境中，细胞形态的变化和 EMT相关标志物表达量的变化。肝癌细胞在正常培养和缺氧诱导下，敲低和过表达HOTTIP,研究HOTTIP对EMT相关标志物mRNA和蛋白表达量的影响。同样采用以上实验，来研究哪个EMT诱导因子介导了长链非编码RNA HOTTIP对EMT标志物的调节作用。
　　3.探究长链非编码RNA HOTTIP对EMT诱导因子调节的具体分子机制。生物信息学筛选出靶向的miRNA。缺氧条件下，分别敲低和过表达HOTTIP来研究miRNA，EMT诱导因子和EMT标志物之间的相关关系。在稳定敲低HOTTIP的细胞中，转染进miRNA inhibitor,研究对EMT诱导因子表达量的影响；最后采用双荧光报告基因的实验，研究HOTTIP和miRNA的竞争强弱对插入到荧光报告载体中的EMT诱导因子的表达影响。敲低以及过表达 HOTTIP后，检测 WDR5蛋白的表达量变化；敲低或过表达WDR5后,检测ZEB1的mRNA和蛋白表达变化;在稳定敲低HOTTIP组,再过表达WDR5,和对照组比较，检测ZEB1蛋白水平能否被恢复。
　　结果：1.肝癌细胞缺氧培养后，长链非编码RNA HOTTIP的表达量明显升高。用DFO过表达或siRNA敲低HIF-1α后，检测到HOTTIP的表达量升高或下降。HOTTIP的启动子区包含HRE的片段插入到PGL3荧光报告基因载体中，敲低或过表达HIF-1α后，荧光活性明显减弱或增强，表明HIF-1α作为转录因子调节HOTTIP的表达。
　　正常培养和缺氧诱导下，敲低或过表达HOTTIP，HIF-1α蛋白表达量明显下降或上升；敲低HIF-1α后，再过表达HOTTIP,检测到HIF-1α的蛋白水平能被恢复。在稳定敲低 HOTTIP的细胞中，用CHX阻断蛋白质翻译，HIF-1α在敲低组蛋白降解的速率明显增强；再用MG132来阻断HIF-1α降解的泛素蛋白酶体途径，在敲低组HIF-1α蛋白表达量也逐渐累积。
　　2.缺氧诱导48h后，肝癌细胞形态变成明显的长梭型，利于细胞的迁移。EMT标志物N-cadherin、Vimentin或E-cadherin的mRNA水平和蛋白表达水平都明显升高或下调。正常培养条件下，敲低和过表达 HOTTIP,EMT标志物 N-cadherin、E-cadherin和Vimentin，EMT诱导因子Snail1、Snail2、ZEB1、ZEB2都没有变化，然而在缺氧诱导的条件下，敲低或过表达HOTTIP后，只有ZEB1和E-cadherin的mRNA和蛋白表达水平都明显变化。
　　3.预测发现 miRNA-200a可能是潜在的靶基因，在缺氧条件下，敲低或过表HOTTIP，miRNA-200a表达上升或下降，ZEB1表达下降或升高，E-cadherin表达升高或下降。在稳定敲低 HOTTIP的细胞中，与对照组相比，ZEB1的表达下降，E-cadherin的表达明显上升，但转染进了miRNA-200a的inhibitor后，ZEB1的表达明显恢复，最终E-cadherin的表达下降；HOTTIP与miRNA-200a结合的区域插到双荧光报告基因载体psiCHECK-2，随着miRNA-200a浓度的增加，荧光活性越来越弱；正常条件和缺氧诱导下，敲低或过表达 HOTTIP发现 WDR5蛋白表达量明显下降或上升，肝癌细胞中敲低或过表达WDR5后，检测到ZEB1的mRNA水平没有变化，蛋白水平明显下降或上升。在稳定敲低HOTTIP组，WDR5蛋白表达水平下降，ZEB1蛋白水平下降，再过表达WDR5后，ZEB1蛋白水平被明显恢复。
　　结论：长链非编码RNA HOTTIP介导了肝癌细胞在缺氧微环境中发生上皮间质转化（EMT）的过程，通过转录因子 HIF-1α转录激活 HOTTIP的高表达，HOTTIP作为ceRNA吸附miRNA-200a,从而促进ZEB1的表达以及HOTTIP能稳定WDR5蛋白，同时促进 ZEB1蛋白的高表达，进而抑制 E-cadherin的表达，最终使肝癌细胞发生转移。