罗格列酮对非酒精性脂肪性肝炎大鼠TNF-α表达作用的研究

目的： 非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)是一种遗传．环境．代谢相关性疾病，是以肝细胞弥漫性脂肪变性和炎症为特征的临床病理综合征。目前NASH的发病机制尚未完全明确，且无有效的治疗方法。现在所公认的发病机制是胰岛素抵抗第一次打击和氧化应激、脂质过氧化、炎性细胞因子释放的“二次打击”学说。初次打击使脂肪肝发生，二次打击导致脂肪肝发生炎症、坏死和纤维化。胰岛素增敏剂噻唑烷二酮类(Thiazolidinediones，TZDs)如罗格列酮(Rosiglitazone)可使过氧化酶体增殖激活受体γ(peroxisome proliferators activated receptors，PPAR-γ)活化，活化的PPAR-γ可抑制Kupffer细胞释放肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素-1(Interleukin-1，IL-1)、白介素-6(Interleukin-6，IL-6)等炎性介质而具有抗炎作用。本实验通过高脂饲料喂养建立NASH大鼠模型，并应用PPAR-γ激动剂罗格列酮给大鼠灌胃，观察PPAR-γ激动剂罗格列酮对NASH大鼠肝损伤的治疗作用及其对TNF-α表达的影响，旨在探讨该药物在NASH中可能的治疗作用及其作用机制。 方法： 45只雄性Wistar大鼠分为正常对照组(10只)和模型组(35只)。以高脂饲料喂养建立NASH大鼠模型，16周末，处死正常对照组大鼠2只，模型组4只，证实造模成功后，将模型组进一步分为4组：治疗对照组(模型组)(8只)、高剂量治疗组(8只)、低剂量治疗组(8只)和联合治疗组(7只)。28周末，股静脉放血处死所有动物，留取血清及肝组织进行以下项目检测：全自动生化分析仪检测各组大鼠血清总胆固醇(cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、丙氨酸氨基转氨酶(alanine transaminase，ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(aspartate transaminase，AST)水平；ELISA法测定血清肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)水平；肝组织用于快速冰冻切片，行SudanⅣ染色，观察肝细胞脂变情况；另以10％甲醛固定，常规包埋、切片，进行苏木精-伊红(HE)染色，观察肝组织的炎症、脂肪变性程度；逆转录聚合酶链反应法(reverse transcription-polymerasechain reaction，RT-PCR)检测肝组织TNF-α mRNA的表达。 结果： 1、一般情况：28周末，正常对照组大鼠，食欲佳，皮毛光滑，精神状态好，体重增加。模型组大鼠精神萎靡，活动减少，食欲减退，消瘦，皮毛欠光泽，体重较前有所下降。治疗组大鼠精神、食欲及活动介于正常对照组与模型组之间。 2、生化指标检测：NASH模型组TC(2.95±0.32mmol/L)、TG(0.88±0.17mmol/L)、ALT(96.63±14.16U/L)、AST(156.13±14.74U/L)明显升高，高剂量治疗组、低剂量治疗组和联合治疗组血清TC(2.03±0.21mmol/L，2.49±0.31mmol/L，2.00±0.24mmol/L)、TG(0.54±0.14mmol/L，0.71±0.14mmol/L，0.52±0.14 mmol/L、)、ALT(67.38±13.68U/L，82.38±12.01U/L，45.14±12.05U/L)、AST(94.25±15.70U/L，129.5±16.70U/L，91.00±16.31U/L)均低于模型组，且高剂量治疗组血脂、转氨酶低于低剂量治疗组，联合治疗组血脂、转氨酶下降最明显。 3、肝脏组织学改变：肉眼观察，正常大鼠肝脏呈红褐色，明亮有光泽。模型组大鼠肝脏体积明显增大，边缘圆钝，呈浅黄色或土黄色，与周围组织有粘连，可见局灶性黄白色变性灶，切面油腻，无光泽。光镜下，正常大鼠肝细胞索以肝小叶中央静脉为中心呈放射状排列。SudanⅣ染色肝细胞胞浆中无红染颗粒。模型组胞浆内充满大量脂肪空泡，出现肝细胞脂肪变性、气球样变，可见小叶内有点状或灶性坏死，坏死肝细胞周围有炎性细胞浸润。高剂量治疗组、低剂量治疗组及联合治疗组肝细胞亦有轻度细胞肿胀，小叶结构基本正常，但肝细胞变性及炎性细胞浸润程度明显减轻。 4、ELISA法检测血清TNF-α水平：模型组血清TNF-α水平(48.231±3.381pg/ml)明显升高；高剂量治疗组、低剂量治疗组及联合治疗组血清TNF-α水平分别是(38.660±3.543pg/ml)、(43.211±3.775pg/ml)、(32.024±3.804 pg/ml)，明显低于模型组(P均<0.01)；高剂量治疗组血清TNF-α水平低于低剂量治疗组(P<0.05)；联合治疗组血清TNF-α水平下降最明显(P<0.01)。 5、RT-PCR.法检测肝组织TNF-αmRNA的表达：正常对照组肝组织TNF-αmRNA表达量(0.224±0.057)很少；模型组肝组织TNF-α mRNA表达(0.954±0.063)显著增强；高剂量治疗组、低剂量治疗组及联合治疗组肝组织TNF-αmRNA表达分别是(0.714±0.059)、(0.851±0.056)、(0.424±0.057)，均明显低于模型组(P均<0.01)，且高剂量治疗组表达低于低剂量治疗组(P<0.01)，联合治疗组肝组织TNF-αmRNA表达明显低于低剂量治疗组(P<0.01)。 结论： 1、采用高脂饲料喂养的方法成功复制了NASH大鼠模型。 2、高脂血症破坏肝脏脂质代谢稳态，激活氧化应激，促进细胞因子释放。 3、以TNF-α为代表的细胞因子参与了NASH的肝损伤。 4、PPAR-γ激动剂下调TNF-α表达，有效控制了炎症，为应用罗格列酮治疗NASH提供了理论基础。