HPV感染与头颈部鳞癌的相关性以及对肿瘤预后的影响

[背景]
　　 头颈部肿瘤的发生和基因遗传、吸烟、病毒感染等多种因素有关。人乳头瘤病毒(HPV)高危型(16/18亚型)感染与头颈部鳞状细胞癌,尤其是口咽鳞状细胞癌的发生密切相关。HPV诱发肿瘤产生的机制,已从分子层面得到逐步阐明。HPV相关的口咽鳞状细胞癌,致癌机制不同于致癌物质所致的鳞状细胞癌,具有分化差但预后好的临床特点,是一种特殊类型的肿瘤,在诊断和治疗方面可能有别于HPV阴性的口咽鳞状细胞癌。国内虽已有少量HNSCC和HPV感染相关的研究,但存在诸多局限性。例如,未能准确评价HPV感染的状态,未能同时对肿瘤组织中Ki-67蛋白、p53蛋白、p16蛋白的表达及它们之间的相关性进行探讨,很少有研究对HPV感染和肿瘤预后之间的关系进行评价。
　　 [目的]
　　 (1)研究人头颈部鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC)组织中人乳头状瘤病毒(human papilloma virus,HPV)感染发生率。评价实时荧光定量PCR方法(Real-time fluorescent quantitative PCR,RT-PCR)与原位杂交方法(in situhybridization,ISH)在测定人头颈部鳞状细胞癌(head and neck squamous cellcarcinoma,HNSCC)组织中人乳头状瘤病毒(human papilloma virus,HPV)的差异。
　　 (2)探讨HPV16/18 DNA阳性与头颈部鳞癌患者的临床指标及Ki-67蛋白、p53蛋白表达、p16蛋白表达的相关性。
　　 (3)评价HPV16/18 DNA阳性、饮酒、吸烟、淋巴结转移、Ki-67蛋白、p53蛋白表达、p16蛋白表达、肿瘤分期等危险因素,对头颈部鳞状细胞癌患者预后的影响。
　　 [方法]
　　 (1)基础研究:对78例HNSCC患者的术后石蜡包埋的肿瘤组织,采用荧光定量PCR方法,测定肿瘤组织中HPV16/18 DNA的含量；采用原位杂交的方法测定肿瘤组织中是否存在HPV16 DNA及HPV18 DNA。采用免疫组化的方法,测定这些患者肿瘤组织中Ki-67、p53、p16蛋白的表达。
　　 (2)临床研究:收集患者的临床资料,包括性别、年龄、临床肿瘤分期、吸烟和饮酒史、治疗措施(手术、放疗和化疗)和生存时间。
　　 (3)统计学方法:应用Kappa一致性检验的方法,评价两种方法检测HPV DNA之间的一致性。应用Spearman相关分析和x2分析的方法,评价HPV16/18 DNA阳性和肿瘤组织中Ki-67、p53、p16蛋白表达及与各项临床指标的相关性。应用多因素COX回归分析,评价HPV16/18DNA阳性、Ki-67蛋白、p53蛋白、p16蛋白、肿瘤分期、淋巴结转移状态、性别、年龄、吸烟和饮酒史等对生存时间的影响。
　　 [结果]
　　 (1)HPV感染的发生率:78例头颈部鳞癌患者,应用RT—PCR方法62.8％患者头颈部鳞癌组织中检测到HPV16/18 DNA,应用原位杂交方法47.4％患者肿瘤组织中检测到HPV16DNA。此外,用原位杂交的方法,有1.28％(1例)患者检测到HPV18 DNA,该患者同时原位杂交方法检测HVP16DNA阳性。用RT—PCR方法,唇、口腔、口咽、下咽的HPV16/18DNA阳性率分别为33.3％、66.67％、70％和57.14％,不同部位的HPV阳性率无显著性差异(P均>0.05)；用原位杂交方法,唇、口腔、口咽、下咽的HPV16 DNA阳性率分别为33.3％、43.8％、60.0％和57.1％,不同部位的HPV阳性率无显著性差异(P均>0.05)。总体上,两种方法在检测HPV16/18DNA方面具有较高一致性(Kappa一致性检验,Kappa=0.595,P=0.000),但存在部位差异:在唇和下咽部位,两种方法检测结果的一致性较高(Kappa值均为1,P分别为0.067和0.000)。在口咽部位,两种方法检测结果的一致性较差(Kappa=0.348,P=0.5)。
　　 (2)免疫组化:患者肿瘤组织Ki-67的表达水平在2％～70％之间,46.15％(36/78)的患者肿瘤组织表达p53蛋白,30.77％(24/78)患者肿瘤组织表达p16蛋白。
　　 (3)相关性分析:HPV16/18DNA阳性(RT—PCR与ISH两种方法)与患者的性别、吸烟、饮酒、临床分期、肿瘤部位、淋巴结转移无显著性相关(P均>0.05),与病理学分级呈正相关(P分别为0.001和0.000),即病理分化差的人群中,HPV16/18DNA阳性率更高。在口咽+下咽癌组患者中,HPV16/18DNA阳性与p53蛋白表达呈负相关(P分别为0.011和0.017),即HPV16/18DNA阳性组患者的肿瘤组织,p53蛋白表达减少。在G3低分化患者中,HPV16/18DNA阳性组患者肿瘤组织,p53蛋白表达减少(P分别为0.002和0.022)。HPV16/18DNA是否阳性与Ki-67表达无相关(P>0.05)。HPV16/18DNA阳性组肿瘤组织的p16蛋白表达减少(P分别为0.026和0.023)。p16表达与p53表达呈正相关(P=0.044),与Ki67表达呈负相关(P=0.047)。
　　 (4)生存和多因素预后分析:78例患者中,6例患者术后即失访,其余患者中位随访21.5个月,随访终点为患者死亡或至2010.9最后一次随访。
　　 ①根据RT—PCR测定方法,HPV16/18DNA阴性和阳性组患者的中位生存时间分别为25个月和44个月(P=0.508)。
　　 ②根据原位杂交方法,HPV16 DNA阴性和阳性组患者的中位生存时间分别为28个月和30个月(P=0.631)。
　　 ③根据p16蛋白表达状态对患者的生存时间进行分析,p16阴性组的中位生存时间30个月,阳性组尚未出现中位生存时间。
　　 ④根据患者肿瘤组织病理学级别,我们将患者分为高分化(G1)、中分化(G2)和低分化(G3)三组,分析HPV16/18感染状态对生存的影响。在高分化(G1)组患者中,HPV阴性和阳性组,均未得到中位生存时间；在中分化组(G2)患者中,HPV阴性和阳性患者的中位生存时间分别为18和27个月(P=0.129)；在低分化组(G3)患者中,HPV阴性和阳性患者的中位生存时间分别是15和44个月(P=0.098)。
　　 ⑤按肿瘤发生部位把患者分成唇+口腔组和口咽+下咽组。唇+口腔组的患者中,HPV16/18DNA阴性组及阳性组的中位生存时间分别为28和44个月(P=0.593)；口咽+下咽组的患者中,HPV16/18DNA阴性组和阳性组的中位生存时间分别为25个月和28个月(P=0.696)。
　　 ⑥按肿瘤总分期把患者分为2组,早期组(0期+Ⅰ期+Ⅱ期)和晚期组(Ⅲ期+Ⅳ期):早期组患者中,HPV16/18DNA阴性组的中位生存时间为28个月,阳性组尚未得出中位生存时间(P=0.553)；晚期组患者中,HPV16/18DNA阴性组和阳性组的中位生存时间分别为18和30个月(P=0.770)。
　　 ⑦按年龄不同,把患者分成<50岁组和≥50岁组。在<50岁组的患者中,HPV16/18DNA阴性组和阳性组的中位生存时间分别为25和35个月(P=0.601)；在≥50岁组的患者中,HPV16/18DNA阴性组和阳性组的中位生存时间分别为28和44个月(P=0.595)。
　　 ⑨多因素COX回归分析显示,影响患者预后的主要危险因素为Ki-67表达(RR2.341,P=0.012)与淋巴结转移(RR1.049,P=0.007),而HPV16/18DNA是否阳性并不是影响患者预后的主要因素(RR1.012,P=0.547)。
　　 [结论]头颈部鳞癌组织中HPV感染发生率RT—PCR方法检测为62.8％,HPV16/18原位杂交方法检测为47.4％,两种方法检测HPV感染的一致性很高。口咽癌HPV阳性率最高。HPV感染相关的HNSCC与病理分化更差有关。p16表达和p53表达相关,和Ki-67蛋白表达呈负相关。单因素分析显示HPV16/18DNA阳性患者生存期较阴性患者有延长趋势,多因素COX回归分析显示Ki-67蛋白表达和淋巴结转移是影响患者生存时间的主要危险因素。