海洋微生物多糖水解酶的基因克隆和高效表达

地球上的生命在海洋中诞生，至今已有数亿年的历史。海洋面积广阔，并拥有一系列复杂的生境和最多样的生命形式。海洋环境中，微生物之间空间和营养的竞争的选择压力导致了微生物的进化，这种进化促使微生物产生多样性的酶系统来适应竞争性的海洋环境。因此海洋微生物酶凭借其独特的特性，可以广泛应用于生物催化反应中。其中有关海洋微生物碳源利用的多糖水解酶多样性十分丰富，而且在发酵生产和生物质能源利用中有十分重要的应用价值。本论文就着重研究海洋微生物多糖水解酶中的褐藻胶裂解酶、k-卡拉胶酶和菊糖酶，并对其进行特性分析、基因克隆和高效表达。
　　 褐藻胶裂解酶基因ALY扩增自海洋病原菌Vibrio sp.QY101，连接到酵母表面展示质粒pINA1317-YlCWP110，在Yarrowia，lipolytica Polh中进行表面展示表达。展示有褐藻胶裂解酶的转化子菌落够在褐藻胶平板上形成透明圈，酶活力最高的转化子His7褐藻胶裂解酶展示酶活力为208.0±5.3 U/g细胞干重。展示有褐藻胶裂解酶的酵母菌体可以水解β-D-甘露聚糖(M)、α-L-古罗聚糖(G)和褐藻胶，产生不同聚合度的具生物学活性的褐藻胶寡糖。
　　 从中国黄海腐烂海藻表面分离到一株产k-卡拉胶酶的海洋细菌LL1鉴定为Pseudoalteromonas porphyrae。其胞外分泌的k-卡拉胶酶经超滤浓缩、阳离子交换层析和分子筛纯化，得到经SDS蛋白电泳检测为40.0 kDa的单一条带。纯化k-卡拉胶酶的最适温度55℃，最适pH8.0，最适底物k-卡拉胶，Km值为4.4 mg/mL，Vmax值为0.1 mg/(min·mL)。纯化k-卡拉胶酶水解k-卡拉胶的最终产物经电喷雾离子化质谱(ESI-MS)分析为硫酸新k-卡拉二糖和硫酸新k-卡拉四糖。
　　 采用反向PCR和基因组步移的方法克隆了P.porphyrae LL1的k-卡拉胶酶基因和其转录调节因子基因。k-卡拉胶酶基因(登录号：GU386342)ORF框1224bp，推导407个氨基酸，蛋白预测分子量42.5kDa。保守区具有糖水解酶家族16的特征序列E(162)xD(164)x(x)E(167)。k-卡拉胶酶转录调节因子ORF框318 bp，推导蛋白105个氨基酸，预测分子量12.1 kDa，属于AraC家族，具有两个转角-螺旋-转角结构的DNA结合域。随后构建k-卡拉胶酶基因双拷贝片段转化Y.lipolytica Polh，所表达的酶嵌壁，酶活力4.9±1.2U/mL，比活力为210.3±3.2U/g细胞干重。重组k-卡拉胶酶最适作用温度和pH较原始酶没有变化，温度稳定性提高。转化子细胞可以将k-卡拉胶水解成硫酸新k-卡拉二糖和少量硫酸新k-卡拉四糖。在k-卡拉胶2.0 mg/mL，重组k-卡拉胶酶量7.5 U/mgk-卡拉胶，反应温度55℃，反应时间40 min的最优水解条件下，k-卡拉胶的水解率为71.5·0.2％。因此重组k-卡拉胶酶在制备具生物活性k-卡拉胶寡糖方面有潜在应用价值。
　　 菊糖和含菊糖作物是用于发酵生产生物酒精及其他有价值代谢产物的重要碳源物质。为了构建在Pichia guilliermondii酵母稳定遗传的重组菊粉酶表达质粒，本研究通过重叠延伸PCR和酶切连接构建了新的rDNA插入型表达菊糖外切酶基因质粒pMD-rDNA-HPT-INU，该质粒转化对潮霉素B敏感的天然P。guilliermondii菌株。经潮霉素平板租PCR验证证明菊糖酶基因重组到染色体中，酶活力最高的转化子R3经过72 h培养，菊糖酶活力达到53.2±2.1U/mL，较天然菌株的菊糖酶活力32.5±0.7U/mL提高65.6％。将转化子R3进行1.5 L发酵罐分批补料发酵，酶活力到达84.1±0.9U/mL。
　　 为了进一步提高菊糖酶活力，以P.guilliermondii经定点突变改造的菊糖酶基因INUM为基础，用易错PCR的方法进行体外分子进化。通过转入Ycplac33进行转化子筛选测序，得到高酶活力菊糖酶基因INUDV82，将其与原基因INUM进行比对分析发现共有5个碱基、4个氨基酸发生变化，并进一步分析酶三级结构和催化位点的变化，发现其中突变氨基酸S97改善了催化中心内的电荷环境，间接增强了酶与底物之间的相互作用。将INUDV82基因连到rDNA重组表达质粒pMIRSC11，转入耐酒精的尿嘧啶缺陷型酵母S.cerevisiae W12d，获得的酶活力最高的转化子INUDV5，菊糖酶活力为25.0±1.8 U/mL，较原INUM基因转化子菊糖酶活力16.75±1.5U/mL，提高49％。