microRNA-34a通过靶向调控Wnt/β-catenin通路中Wnt1蛋白抑制乳腺癌的进展

研究背景:
　　乳腺癌(breast cancer，BC)是目前最为普遍爆发的恶性肿瘤之一，每年大约有三十五万人死于乳腺癌，对女性的生命健康构成严重威胁。许多因素与乳腺癌的发生有潜在联系，包括年龄的增长、外用激素、超重、酗酒和吸烟等。近十年来乳腺癌的诊疗方法有了突飞猛进的发展，但由于它的高发性和高致死性等特点，至今仍然是女性健康的一大杀手。因此，人们更多地关注乳腺癌发生的分子机制，希望可以发现其病理发生和发展的机制所在。
　　微小RNA(microRNA，miRNA)是一类长度只有大约18-25个核苷酸大小的内源性非编码RNA。在大多数生物中，编码微小RNA的基因占到全基因组的1-3％，微小RNA虽然不直接参与编码蛋白质，但其常常在翻译后水平调节目标基因的表达。众所周知微小RNA可以同时调节许多目标mRNA表达，从而调控包括细胞增殖、分化等一系列细胞功能。之前文章报导显示，微小RNA可以作为新的抗癌治疗靶点。
　　miR-34是一大类miRNA肿瘤抑制基因，因为在细胞周期和细胞存活的控制中其重要作用，其作为抗癌治疗药物已进入临床试验阶段。miR-34广泛存在于各种生物体内，其家族成员之间存在高度同源序列，在进化上十分保守。miR-34已被证明可以通过靶向调节与细胞周期阻滞和凋亡相关的一系列基因，对决定细胞命运起关键作用，在哺乳动物DNA损伤时，p53在转录水平上使miR-34上调。一系列实验表明miR-34家族成员是p53的直接靶点，他们的上调可以诱导细胞凋亡及细胞周期阻滞。除了失活的p53突变或病毒表达的p53抑制剂可以降低miR-34的表达量，miR-34编码基因本身可以在癌症中发生基因突变或表观遗传水平上的失活。由此看出，miR-34a的表达量下调或甲基化失活与肿瘤的发生密切相关。其中，microRNA-34a(miR-34a)是被研究得最为深入的抗癌基因之一，它位于1号染色体长臂的36号区域。除了抗癌以外，miR-34a还可以诱导细胞周期调控、凋亡、衰老、抑制上皮间质转化、抑制癌干细胞增殖等。更多证据显示miR-34a在乳腺癌患者体内可以靶向调控很多基因，包括Fra-1、 LMTK3、Bcl-2、Notch。由此表明miR-34a与乳腺癌的发生发展相关，但具体机制尚未阐明，于是我们的研究试图探究此机制。
　　第一部分 miR-34a在乳腺癌组织及细胞系中的表达情况
　　目的:
　　本部分通过大量实验，拟解决以下问题:miR-34a的表达在乳腺癌的组织及各细胞系中是否相对于正常乳腺细胞系有所不同？miR-34a在乳腺癌发生发展中是否受到抑制？
　　材料与方法:
　　我们从随机选取2014年3月到2015年8月期间在山东大学附属齐鲁医院接受手术的123例乳腺癌患者体内获得了其肿瘤组织和配对的非肿瘤正常组织，以及人类乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435、人类胚胎肾细胞系HEK293T以及人类正常乳腺上皮细胞系MCF-10A，利用定量RT-PCR及原位杂交的方法检测不同组织和细胞系中miR-34a的表达量。
　　实验结果:
　　原位杂交及定量PCR结果显示，与正常组织活细胞系相比，miR-34a在乳腺癌组织中的表达明显下调(P＜0.05)。与MCF-10A正常乳腺细胞系相比，miR-34a在MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435乳腺癌细胞系中的表达量明显降低(P＜0.05)。说明miR-34a很可能参与影响乳腺癌的发生和发展。
　　实验结论:
　　实验表明miR-34a与乳腺癌发生发展是负相关的，可以作为的一个抑制因素，调节其进展。
　　第二部分 miR-34a以Wnt1为直接靶点调节乳腺癌中Wnt/β-catenin通路
　　目的
　　了解miR-34a调节乳腺癌发生发展的下游调控靶点及通路是什么？
　　材料与方法:
　　接着我们用生物信息学方法预测出Wnt1是miR-34a的下游直接靶向基因，并且用双荧光素酶报告实验来证明这个结论。将Wnt1野生型的3’末端全长克隆到荧光素酶基因载体pMIR-REPORT的下游，将miR-34a与野生型Wnt1的3’末端共转染到293T细胞中，研究在miR-34a的刺激下是否能够导致荧光素酶活性。将野生型和突变型Wnt1的3’末端和miR-34a一同转染人胚肾293T细胞，72小时后，以海肾荧光素酶活性作为内参，计算相对荧光素酶活性值。
　　当转染miR-34a模拟物和抑制剂后，用定量RT-PCR及western blot实验检测MCF-7乳腺癌细胞中Wnt1和其他Wnt/β-catenin通路相关基因的表达量，进一步证实miR-34a可以抑制Wnt/β-catenin通路的激活。
　　实验结果:
　　野生型Wnt1与miR-34a共转染可以导致荧光素酶活性大幅度降低(P＜0.05)，即miR-34a可以导致Wnt1表达量下调;而miR-34a共转染不会引起Wnt突变体荧光素酶活性的降低。并且，MCF-7细胞中miR-34a表达量增加能导致Wnt1表达量的下调(P＜0.05);而抑制miR-34a的表达后，Wnt1的表达水平均明显上升，miR-34a表达量上调使β-catenin大幅度表达量下调(P＜0.05)。cyclin-D1在转染有miR-34a的MCF-7细胞系中的表达量也受到miR-34a增加的影响而明显下调(P＜0.05)。抑制miR-34a的表达后，β-catenin、cyclin-D1的表达水平均明显上升。
　　实验结论:
　　这些结果说明，Wnt1是miR-34a的直接下游调控靶点，miR-34a过表达可以导致Wnt/β-catenin通路的失活。
　　第三部分 miR-34a能够通过靶向调节Wnt1而抑制乳腺癌进展并且通过失活Wnt/β-catenin通路抑制肿瘤生长
　　目的:
　　探究miR-34a与乳腺癌发生发展的关系是如何通过下游信号通路体现的。
　　材料与方法:
　　转染后的MCF-7细胞的增殖、侵袭、迁移水平分别用MTT实验、划痕实验、transwell实验来检测，分析miR-34a在体外实验中对肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移的影响。
　　并且，我们建立了乳腺癌异种移植模型，在小鼠体内注射miR-34a抑制剂，测量注射前后肿瘤的大小和重量，并利用定量PCR和western blot方法检测Wnt1、β-catenin、cyclin-D1表达量，来判断miR-34a对乳腺癌体内生长及Wnt/β-catenin通路活性的影响。
　　实验结果:
　　miR-34a过表达使细胞增殖速率明显下降;而当细胞转染miR-34a抑制剂后，增殖速率明显增加(P＜0.05)。并且，若转染miR-34a抑制剂的MCF-7细胞同时转染Wnt1小干扰RNA(siRNA)，使细胞内表达的Wnt1减少，乳腺癌细胞增殖将下降。
　　划痕实验和穿孔实验结果表明，miR-34a过表达的乳腺癌细胞迁移和侵袭能力比对照组均有所降低(P＜0.05);当miR-34a抑制剂转染细胞后，迁移和侵袭能力有很大提高。另外同时转染miR-34a和Wnt1小干扰RNA的细胞，迁移和侵袭能力都受到明显抑制。
　　用miR-34a抑制剂处理过的小鼠的肿瘤大小和重量都较大(P＜0.05):肿瘤大小平均能达到834.3±159.6立方毫米;重量达到平均891.8±115.2 mg。另外，另外，转染miR-34a模拟物可以抑制肿瘤生长(P＜0.05)。注射miR-34a抑制剂的小鼠体内异种移植物Wnt1、β-catenin、cyclin-D1表达量均明显增加(P＜0.05)。
　　实验结论:
　　这些结果表明miR-34a在体内的下调与乳腺癌细胞增殖、迁移、侵染能力增强有关。体内实验表明miR-34a通过与Wnt/β-catenin信号通路相互作用而抑制乳腺癌肿瘤的体内生长。