长链非编码RNA与结直肠癌易感性及预后相关研究

目的：1.探讨 lncRNA基因遗传变异与结直肠癌发病风险的关联；2.探讨lncRNA基因遗传变异对结直肠癌患者预后的影响；3.从 lncRNA表达谱入手，筛选出与结直肠癌相关的差异表达 lncRNA；4.在表达水平上对部分筛选的lncRNA进行验证，并分析其异常表达对结直肠癌患者预后的影响。
　　方法：首先采用病例-对照研究设计分析 lncRNA基因遗传变异对结直肠癌易感性的影响。运用中通量MassARRAY基因分型技术对肿瘤相关关键lncRNA基因的候选SNPs进行分型。应用Pearson?2检验、Cochran-Armitage趋势检验及非条件Logistic回归模型分析候选SNPs与结直肠癌发生风险的关联，并对基因-基因、基因-环境交互作用进行探讨。采用Log-Rank检验和Cox比例风险模型分析候选SNPs对结直肠癌患者术后总体生存时间的影响。利用公共生物信息数据库 GEO，通过对结直肠癌 lncRNA表达谱数据集的分析，筛选出与结直肠癌相关的差异表达lncRNA。通过GO和KEGG分析，对差异表达lncRNA的邻近差异表达基因的功能进行聚类富集分析，预测差异表达lncRNA可能涉及的生物过程及参与的信号通路。采用实时荧光定量 PCR方法对部分筛选的差异表达lncRNA进行检测和验证。通过ROC曲线，评估阳性lncRNA鉴别结直肠癌组织的能力。结合临床病理信息及随访资料，分析差异表达lncRNA与结直肠癌患者不同临床病理特征及术后总体生存时间的关系。
　　结果：1.病例-对照研究中，我们共纳入695例结直肠癌患者和701例健康对照。在环境危险因素分析中，发现吸烟、饮酒及肿瘤家族史是结直肠癌发病的危险因素。吸烟者结直肠癌的发生风险是不吸烟者的1.42倍（95％CI=1.14-1.81）；饮酒者结直肠癌的发生风险是不饮酒者的1.93倍（95%CI=1.43-2.59）；肿瘤家族史能够显著增加结直肠癌的发病风险（OR=1.73，95%CI=1.27-2.34）。吸烟、饮酒、肥胖及肿瘤家族史与结直肠癌患者术后的总体生存时间无显著关联（P>0.05）。
　　2.在lncRNA遗传变异与结直肠癌发生风险及预后研究中，我们对lncRNA基因的16个关键SNPs进行了分析。研究发现，所纳入的16个遗传位点与结直肠癌的易感性未见显著关联。但分层分析发现，在<58岁人群中，PRNCR1 rs13252298 GG基因型与结直肠癌的发病风险为临界相关，调整 OR值为0.52（95%CI=0.26-1.04）。在≥58岁人群中，UCA1 rs12462414每增加一个T等位基因，结直肠癌的发病风险增加33%（OR=1.33，95%CI=1.03-1.71）。在女性人群中，UCA1 rs12462414每增加一个 T等位基因，结直肠癌的发病风险增加40%（OR=1.40，95%CI=1.04-1.87）。生存分析发现H19上的rs2107425 CT基因型的结直肠癌患者相比携带CC基因型的患者，结直肠癌术后死亡的风险增加，结果具有边缘显著性（HR=1.55，95%CI=0.99-2.41）。H19 rs217727每增加一个危险等位基因 A，结直肠癌患者术后死亡的风险增加35%（HR=1.35，95%CI=1.02-1.77）。MALAT1 rs619586 GG基因型携带者结直肠癌术后死亡风险为AA基因型携带者的10.31倍（95%CI=1.32-80.59）。
　　3.通过GEO中结直肠癌lncRNA表达谱芯片分析发现，在结直肠肿瘤细胞中有176个lncRNA的表达水平存在差异，其中98个表达上调。在结直肠癌组织中有2474个lncRNA的表达水平存在差异，其中1613个表达上调。GO分析发现差异表达lncRNA可能涉及的生物过程有：白介素6受体结合、生长因子受体结合、蛋白结合、细胞生长调节、胰岛素样生长因子结合等。KEGG分析发现差异表达的lncRNA可能参与的信号通路有：脂肪的消化和吸收、甘油酯代谢、肠道免疫网络的IgA产生、NOD样受体信号通路炎症性肠病等。
　　4.差异表达 lncRNA的验证分析发现，lncRNA AK022914、AP000525.8、UCA1在结直肠癌组织中的相对表达量高于正常组织，表达上调，C17orf91表达下调（P<0.05）。qPCR验证的四种lncRNA差异表达方向与芯片的结果一致。ROC曲线分析发现，AK022914、AP000525.8、UCA1、C17orf91的曲线下面积分别为70.5%、67.1%、68.5%和59.8%。AK022914鉴别结直肠肿瘤组织和正常组织的能力最佳，其灵敏度、特异度可分别达到71.2%、67.3%。分析发现 UCA1 rs12462414遗传变异与lncRNA UCA1表达量之间未见显著关联。生存分析发现，lncRNA C17orf91低表达可显著降低结直肠癌患者术后死亡风险（HR=0.21，95%CI=0.06-0.75）。
　　结论：1.吸烟、饮酒及肿瘤家族史是结直肠癌发病的危险因素；2.所纳入的lncRNA遗传变异与结直肠癌的发病风险无明显关联。但在≥58岁人群和女性人群中，UCA1 rs12462414遗传变异可增加结直肠癌的发病风险。3. lncRNA H19 rs217727和MALAT1 rs619586遗传变异与结直肠癌患者术后的总体生存时间相关。4. lncRNA AK022914、AP000525.8和UCA1在结直肠癌组织中的表达上调，C17orf91表达下调，可能与结直肠癌的发生存在关联。5. lncRNA C17orf91表达下调有利于提高结直肠癌患者术后总体生存时间，降低死亡风险。以上研究结论仍需要在大样本人群中进行验证，且需要更多的生物学研究以明确与结直肠癌发生发展相关lncRNA的功能及作用机制。