异养细菌Cupriavidus pinatubonensis JMP134的亚硫酸盐脱毒机制

亚硫酸盐作为抗氧化剂、防腐剂等广泛应用于食品、医药等工业，但是亚硫酸盐同时也是一种潜在的毒性物质，在生物体内大量积累会对机体的DNA和蛋白质等造成不可逆的损伤。生物体内对亚硫酸盐的脱毒处理就显得尤为重要。生物体内亚硫酸盐的脱毒主要有3种途径:由亚硫酸盐输出蛋白将亚硫酸盐输出到胞外;通过亚硫酸盐氧化酶的直接氧化或AMP依赖性的间接氧化将亚硫酸盐氧化成硫酸盐;被亚硫酸盐还原酶还原成硫化物，进而参与含硫有机物的合成。
　　本论文以异养细菌Cupriavidus pinatubonensis JMP134为模式菌株，研究亚硫酸盐的脱毒机制。TauE属于一个功能不太清楚的蛋白家族DUF81，包含8个跨膜螺旋，序列比对发现TauE和已经报道的亚硫酸盐输出蛋白的相似性很高，因此推测其功能可能与亚硫酸盐的输出有关。生物信息学分析结果显示，该菌株中同时存在10个tauE同源序列，但是只有4个与硫代谢基因相邻。我们以这4个tauE和另外2个不和硫代谢基因相邻的tauE为主要研究对象，进一步研究TauE的功能。
　　利用无痕敲除的方法构建了tauE的一系列敲除株，以野生菌株作对照，开展了一系列实验。发现:(1) tauE的多敲除菌株以牛磺酸作为唯一硫源的生长变弱，回补tauE后菌株的生长能力得到提高，说明TauE具有外排牛磺酸的代谢产物（亚硫酸盐）的功能;(2)tauE单敲除菌株对亚硫酸盐的耐受性没有发生改变，说明TauE外排亚硫酸盐的功能很可能是由多个TauE协同作用;(3)一些多敲除菌株亚硫酸盐的耐受性变弱，耐受性由大到小依次为:Cp＞ΔT12=ΔT1234＞ΔT126＞ΔT1256，因此推测TauE输出亚硫酸盐的功能是由4个与硫代谢基因相邻的tauE同源序列(tauE1、tauE2、tauE5、tauE6)协同发挥作用的;(4)各个敲除株对亚硫酸盐的代谢产物和野生株不存在明显差异，说明TauE与亚硫酸盐的胞内氧化没有直接关系;(5)亚硫酸盐的外排实验显示，体外添加亚硫酸盐不能使胞内形成大量的亚硫酸盐积累，因此未检测到明显的亚硫酸盐外排;(6)利用激光共聚焦显微镜对TauE进行定位，发现其存在于细胞膜上，符合输出蛋白的特点。通过以上实验得出结论，在JMP134中TauE是一个跨膜蛋白，具有亚硫酸盐输出解毒的功能，该功能由4个与硫代谢基因相邻的tauE同源序列协同发挥作用。
　　将tauE在酿酒酵母亚硫酸盐输出蛋白缺陷菌株ΔSsu1中过表达，若tauE回补菌株可以提高ΔSsu1对亚硫酸盐的耐受性则认为TauE具有输出亚硫酸盐解毒的功能。实验结果显示tauE回补菌株没有提高ΔSsu1对亚硫酸盐的耐受性。出现该结果的原因推测是:原核的TauE不能在真核酵母中正常发挥功能。
　　JMP134中负责亚硫酸盐解毒的另外一条途径是将亚硫酸盐氧化为硫酸盐。SorAB被认为是负责该氧化途径的关键酶，定位在周质空间。为了探究其功能，我们构建了sorA的敲除菌株和回补菌株，并检测其在亚硫酸压力下的耐受生长状况，发现敲除株生长变弱，回补sorA后菌株的生长得到一定程度的提高;检测菌株代谢亚硫酸盐的胞外产物，发现敲除sorA后菌株几乎不能氧化亚硫酸盐，回补sorA后菌株又可以氧化亚硫酸盐;由此得出结论:SorAB可以通过氧化亚硫酸盐实现亚硫酸盐的脱毒。