农杆菌介导的高粱遗传转化及木质素合成相关基因的多态性研究

高粱是世界第五大粮食作物，又是饲料、酿酒、工业淀粉、以及生物能源的原材料，是集食用、饲用、能源于一体的多用途作物。同时高粱作为一种C4植物，光合效率高，生长期短，耐瘠薄，对高温、干旱、盐碱、渍涝有较强的抵抗力和适应力。高粱BT×623基因组较小(750Mb)，且已完成测序，使其成为继水稻之后又一重要的粮食和能源模式作物。通过基因工程途径进行高粱遗传改良是今后高粱育种的重要方法之一，但由于高粱的高频再生和高效的转化体系较难建立，其遗传转化研究工作发展滞后，受体的选择、外源基因导入的方法、转基因植株的筛选是遗传转化的三个重要环节，直接影响转化效率。因此本实验致力于选择高效的转化方法，将外源基因导入合适的受体细胞，并使用方便快捷的筛选方法鉴别出阳性植株。
　　AtMYB12是拟南芥决定花青素时空表达的特异转录因子，它可调控转化细胞合成紫红色的花青素，从而使转化细胞与未转化细胞易于区别。我们构建了带有可见标记基因AtMYB12的pCAMBIA3301表达载体，通过真空抽滤辅助农杆菌介导的高粱萌发种子芽尖转化，获得阳性转基因植株。AtMYB12作为转基因细胞/组织的筛选和鉴定标记，具有简单、快捷、直观、活体可见等特点，无需染色、无需大型精密仪器且极其灵敏，也可用于胚型愈伤组织转化后阳性细胞的筛选。高粱种子经灭菌、萌发，划胚、真空抽滤辅助农杆菌转化，经共培养、抑菌、洗涤、移栽和检测等过程完成对高粱萌发种子遗传转化。最优方案为:种子灭菌使用0.1％的升汞（加吐温80），灭菌20分钟时，洗涤6-7次;真空抽滤辅助农杆菌浸染，菌液浓度OD6000.4-0.6，抽真空30分钟，共培养后使用替卡西林加头孢噻肟钠去除农杆菌，总转化效率最高可达4％，因转基因植株移栽后部分死亡，使成活后的转化率降为1.1％。
　　分别克隆了高粱12种bmr突变体及野生型BT×623的CAD7、C4H、PAL-2和PAL-8等木质素合成途径关键酶基因，经测序、比对后发现CAD7基因的突变体bmr22、bmr27、BN603中各存在一处无义突变，但位置明显不同;所有突变体中C4H基因正常;bmr23突变体的PAL-2基因存在一处无义突变和一个可变剪接;PAL-8基因的所有突变体中均存在可变剪接。