食管鳞癌中SOX7基因表达及其甲基化状态研究

目的:我国是食管癌的高发国，由于食管癌临床表现的隐匿性，多数患者就诊时已属中晚期，预后差，严重威胁着人们的健康。因此，探索食管癌的发病机制及寻找有效的基因治疗靶点，是降低食管癌发病率及死亡率的重要途径。
　　食管癌发病是多因素、多阶段、多基因变异的复杂过程，在分子水平上涉及众多原癌基因、抑癌基因以及蛋白质的改变。基因的表观遗传学修饰是不涉及DNA序列改变的一种修饰形式，其中基因甲基化是最常见的修饰途径。研究表明许多肿瘤组织中均存在SOX基因家族的异常表达，而SOX基因家族又与Wnt/β-catenin信号通路有着密切的关系。SOX7基因作为此家族的重要成员日益引起研究者的重视。序列检索发现，SOX7基因的启动子区存在多个CpG岛，推测该基因也可能存在甲基化修饰现象。本研究通过检测食管癌细胞系和食管癌患者癌组织及相应癌旁组织中WNT通路相关基因SOX7启动子区的甲基化状态，并分析与该基因mRNA及蛋白表达的相关性，探讨SOX7基因在食管鳞癌中的作用及表达调控机制。
　　方法:
　　1应用逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chainreaction，RT-PCR)技术分别检测DNA甲基转移酶抑制剂5-aza-dC处理前后的食管癌细胞系(Yes-2、EC109、TE1、T.TN)以及58例食管鳞癌组织及癌旁组织中SOX7基因的mRNA表达情况。
　　2应用免疫组织化学(immunohistochemistry) SP法检测58例食管鳞癌组织及癌旁组织中SOX7蛋白的表达情况。
　　3应用甲基化特异性PCR(methylation specific polymerase chain reaction，MSP)技术分别检测5-aza-dC处理前后的食管癌细胞系和58例食管鳞癌组织及癌旁组织中SOX7基因的甲基化状态。
　　4运用统计软件SPSS13.0对数据进行统计学分析。
　　结果:
　　1食管鳞癌中SOX7基因mRNA、蛋白表达以及与各临床指标之间的关系
　　1.1食管鳞癌及相应癌旁组织中SOX7基因mRNA表达情况及与各临床指标之间的关系
　　SOX7基因mRNA在食管鳞癌组织中的相对表达量为0.36±0.09，在癌旁组织中的相对表达量为0.61±0.13，食管鳞癌组织中SOX7基因的mRNA表达量明显低于癌旁组织，其差异具有统计学意义(t=12.772，P＜0.05)。在食管鳞癌患者中，SOX7的mRNA表达与患者肿瘤TNM分期、病理分级和淋巴结转移均有关(P＜0.05)。
　　1.2食管鳞癌及相应癌旁组织中SOX7基因蛋白表达情况及与各临床指标之间的关系
　　58例食管鳞癌组织中有16例SOX7基因蛋白表达阳性，阳性表达率为27.6％(16/58);而相应癌旁组织中有42例SOX7蛋白呈阳性表达，阳性表达率为72.4％(42/58)，食管鳞癌组织中该基因蛋白阳性表达率显著低于相应癌旁组织(x2=16.004，P＜0.01)。在食管鳞癌中，SOX7蛋白表达与患者的淋巴结转移有关(P＜0.05)，而与肿瘤组织分期和分级无关(P＞0.05)。
　　2食管鳞癌中SOX7基因表达下调的机制研究
　　2.1 SOX7 mRNA在食管癌细胞系中经5-aza-dC处理前后的表达情况
　　检测Yes-2、EC109、TE1、T.TN四株食管癌细胞系中SOX7基因mRNA表达情况，发现TE1中SOX7基因mRNA表达呈阳性，Yes-2、EC109、T.TN细胞株中该基因mRNA表达缺失，经5-aza-dC处理培养后，四株细胞系均检测出SOX7 mRNA的表达。
　　2.25-aza-dC处理前后食管癌细胞系中SOX7基因的甲基化状态
　　在5-aza-dC处理前Yes-2、EC109、T.TN细胞株中SOX7基因表现为高甲基化状态，应用甲基化抑制剂5-aza-dC处理后该四种细胞株中SOX7基因均表现为非甲基化状态。在5-aza-dC处理前TE1细胞株表现为不完全甲基化状态，应用甲基化抑制剂5-aza-dC处理后表现为非甲基化状态。
　　2.3食管鳞癌组织中SOX7基因的甲基化状态及与各临床指标之间的关系
　　在食管鳞癌组织中SOX7基因的甲基化阳性率(53.4％，31/58)显著高于癌旁组织中该基因甲基化阳性率(29.3％，17/58)(x2=8.652，P=0.000)。低分化鳞癌组SOX7基因启动子区甲基化发生率(71.2％，23/31)显著高于高中分化鳞癌组甲基化发生率(29.6％，8/27)（x2=11.518，P＜0.05）;在有淋巴结转移组SOX7基因启动子区的甲基化发生率(69.0％，20/29)显著高于无淋巴结转移组的甲基化发生率(37.9％，11/29)(x2=5.613，P＜0.05);根据TNM分期进行统计分析，Ⅰ+Ⅱ期食管鳞癌组中SOX7基因启动子区的甲基化发生率(41.5％，17/41)显著低于Ⅲ+Ⅳ期食管鳞癌组SOX7基因启动子区的甲基化发生率(82.4％，14/17)(x2=8.074，P＜0.05);SOX7基因启动子区甲基化率与食管鳞癌患者的年龄、性别、吸烟、饮酒等无关(P＞0.05)。
　　2.4食管鳞癌组织中SOX7 mRNA、蛋白表达以及基因甲基化之间的关系
　　SOX7基因发生甲基化的食管癌组织mRNA相对表达量为0.28±0.08，显著低于未发生甲基化的食管癌组织中mRNA的相对表达量0.41±0.08，（t=-6.249，P＜0.05）。SOX7基因启动子区发生高甲基化的食管鳞癌组织SOX7蛋白表达阳性率(12.9％，4/31)显著低于未发生甲基化的食管鳞癌组织SOX7蛋白表达阳性率(44.4％，12/27)(x2=7.187，P＜0.05)。
　　结论:
　　1食管鳞癌组织中SOX7基因mRNA、蛋白的表达低于癌旁组织，提示食管鳞癌中SOX7基因可能为候选抑癌基因，其表达下调可能是食管鳞癌的发病机制之一。
　　2 SOX7基因在多数食管癌细胞株中表达降低或缺失，并呈现高甲基化状态，在经5-aza-dC处理后可逆转高甲基化状态并使SOX7恢复表达，提示甲基化可能是导致SOX7在食管癌中表达下调的机制之一。
　　3食管鳞癌组织中SOX7基因启动子区甲基化状态明显高于相应癌旁组织，提示SOX7基因甲基化可能是食管鳞癌发生的机制之一。
　　4 SOX7启动子区高甲基化状态与分化程度、淋巴结转移及临床分期有关，提示SOX7启动子区高甲基化状态可能与食管鳞癌的发展密切相关，并对食管鳞癌患者的预后可能有一定的指导作用。