IL-17对喉癌细胞Hep-2的增殖、凋亡和迁移的影响及机制研究

目的：喉鳞状细胞癌是最常见的头颈部恶性肿瘤之一，病因尚不十分清楚，但常见的诱发因素有很多种，例如吸烟、饮酒、病毒感染、放射线、膳食习惯、职业因素等。喉癌的临床治疗目前以外科手术治疗加以放化疗为主，尽管可以延长部分患者的存活时间，但总体治疗效果并不十分理想，后遗症并发症比较多，如呛咳、失声、吞咽困难等，严重影响了患者的生命质量。为进一步深入了解喉癌的发生发展机制，以期望找到更有效和可选的分子靶点来预防疾病，并对其进行分子靶向治疗，这是目前提高喉癌的诊治水平和判断预后的重要手段。本研究通过转染IL-17基因，观察Hep-2细胞功能的变化，探讨白细胞介素-17(IL-17)对人喉癌细胞Hep-2增殖、凋亡和迁移的作用及可能存在的机制。
　　方法：构建IL-17重组真核表达载体pEGFP-N1-IL-17，将pEGFP-N1-IL-17瞬时转染Hep-2细胞，同时设置空载体组(pEGFP-N1)和正常对照组。荧光显微镜观察三组细胞的转染情况。通过RT-PCR和Western blotting实验分别检测转染前后各组细胞中IL-17 mRNA和蛋白的表达。MTT增殖实验检测转染前后三组细胞增殖变化，同时应用流式细胞术检测转染前后三组细胞凋亡的变化，通过RT-PCR方法检测转染前后三组细胞各自凋亡相关分子Caspase-3、Caspase-9和Bcl-2的表达变化。细胞划痕修复实验和Transwell小室实验分别观察转染前后三组细胞的横向迁移和纵向迁移能力的变化，Transwell基质胶实验检测转染前后Hep-2细胞侵袭能力的变化，RT-PCR技术方法检测细胞侵袭相关分子MMP-2和MMP-9的mRNA表达。Western blotting实验检测Notch信号通路相关分子Notch1、Hey1和Hes1的表达。
　　结果：Hep-2细胞中没有绿色荧光蛋白GFP的表达，即使有激发光的激发，也不会出现绿色荧光。转染了pEGFP-N1和pEGFP-N1-IL-17的Hep-2细胞，通过荧光显微镜可以看到绿色荧光，且随着转染时间延长，细胞转染效率逐渐增加而荧光逐步增强。RT-PCR和Western blotting实验结果显示，在成功转染pEGFP-N1-IL-17的Hep-2/pEGFP-N1-IL-17细胞中，有IL-17 mRNA和蛋白的表达，正常的Hep-2细胞和转染空载体pEGFP-N1的Hep-2/pEGFP-N1细胞均不表达IL-17。MTT细胞增殖实验和流式细胞术检测细胞凋亡实验发现目的基因IL-17可以抑制Hep-2细胞的增殖，促进Hep-2细胞的凋亡。RT-PCR实验结果显示，转染pEGFP-N1-IL-17后，凋亡相关分子Caspase-3、Caspase-9的表达量明显升高，而Bcl-2的表达量明显下降，差异具有统计学意义(Caspase-3: F=289.52,P＜0.01; Caspase-9:F=20.70,P＜0.01;Bcl-2:F=287.05,P＜0.01)。细胞划痕修复实验、Transwell小室迁移和侵袭实验结果表明，IL-17可以显著抑制Hep-2细胞的迁移和侵袭能力（P＜0.01）。为了进一步探讨IL-17发挥此作用的机制，RT-PCR检测细胞侵袭相关分子MMP-2、MMP-9表达结果发现，与正常对照组相比，转染pEGFP-N1-IL-17组MMP-2、MMP-9的表达量明显下降，差异具有统计学意义(MMP-2:F=223.52，P＜0.01; MMP-9:F=722.46，P＜0.01)。Western blotting检测Notch信号通路中的相关分子(Notch1、Hey1、Hes1)的表达。结果表明，和正常对照组相比，转染pEGFP-N1-IL-17组Notch1、Hey1、Hes1的表达均明显升高，差异具有统计学意义(Notch1-F=176.68,P＜0.01; Hey1: F=265.96, P＜0.01; Hes1: F=131.11,P＜0.01)。
　　结论：⑴Hep-2细胞中不存在IL-17的表达。转染pEGFP-N1-IL-17可以抑制Hep-2细胞的增殖和促进Hep-2细胞的凋亡。可能是IL-17能够促进凋亡相关分子Caspase-3和Caspase-9的表达同时抑制Bcl-2的表达实现的。⑵IL-17能够抑制侵袭相关分子MMP-2和MMP-9等的表达抑制Hep-2细胞的横向迁移、纵向迁移和侵袭能力。⑶IL-17对人喉癌Hep-2细胞的功能影响可能通过Notch信号通路的功能在起作用。