5-氨基乙酰丙酸工程菌的构建与发酵工艺优化

5-氨基乙酰丙酸（5-Aminolevulinic acid,简称ALA）是一种广泛存在于动植物细胞和微生物中的氨基酸衍生物，是合成吡咯类化合物的重要中间体物质。ALA在农业和医药领域具有广泛的应用。在农业领域，ALA可应用于除草剂、杀虫剂以及植物生长调节剂等领域，具有容易降解、残留低等优点。在医药领域，ALA可以用于治疗皮肤癌、膀胱癌、直肠癌等各类癌症。因其具有治疗效果好、毒副作用小、治疗确切稳定等特点。故其在未来癌症治疗领域将有广泛深入的应用。所以，对ALA的进一步开发和应用将有重要的经济效益和社会效益。
　　目前ALA主要通过化学合成和微生物发酵生产，其中化学合成生产方法具有过程复杂、废水处理困难、产物收率不高等缺点。随着人们环保意识的加强，化学合成法有望近期被微生物发酵法替代。但目前微生物发酵法产量较低，还不足以满足工业化生产的要求。随着近年来对微生物菌株的遗传改造，以及发酵工艺的优化等一系列成果的转化，有望突破现在的瓶颈，实现ALA微生物发酵法的工业化生产。
　　本课题以毕赤酵母GS115为工程菌株，通过同源重组的方式，将酿酒酵母的5-氨基乙酰丙酸合酶的基因以组成型表达的方式整合入毕赤酵母GS115的基因组中。成功构建了高产ALA的毕赤酵母转基因工程菌株UJNPA，其生产ALA的产量比未进行基因改造的菌株产量增加2倍。在本课题中选用的重组载体为pGAPZA，启动子为pGAP。
　　然后，以构建的菌株UJNPA为出发菌株，选择与ALA代谢途径有关的6种因素作为考察因子:琥珀酸、甘氨酸、丙二酸、大蒜提取物、乙酰丙酸、甘油。研究这6种因素在发酵后期添加量对ALA产量的影响。通过单因素实验及响应面实验，得出其最优添加量为:琥珀酸6.11g/L、甘氨酸1.67g/L、丙二酸2.46g/L、大蒜提取物7.24mL/L、乙酰丙酸1.50 g/L、甘油8.00mL/L。在此最优添加量条件下，ALA的摇瓶产量为1783.33mg/L。在上述优化条件下，以甲醇为辅助碳源进行单因素实验，间隔12h补加2％(v/v)的甲醇，最终ALA产量达到2256.21mg/L。