脂肪来源Exosome与TRB3介导的管周脂肪炎症在糖尿病血管病变中作用的研究

1研究背景
　　糖尿病是冠状动脉粥样硬化性心脏病等危症的概念已深入人心。多项糖尿病防治指南都将糖尿病是心血管事件独立危险因素、糖尿病患者是心血管疾病的高危人群的观点纳入指南。众多临床试验及荟萃分析结果显示，糖尿病患者的心血管疾病发病更早，病变范围更广并且程度更重，预后更差。
　　目前的循证医学证据表明，严格控制空腹血糖与糖化血红蛋白可以显著降低糖尿病微血管并发症，但对于糖尿病大血管并发症的作用仍存在争议。强化降糖组死亡率较高的情况，提示血糖和胰岛素水平的改变不是导致糖尿病患者急性冠脉综合征的核心因素。因此，探索血糖因素之外的糖尿病血管损伤因子，对于发现糖尿病患者心血管并发症风险增高的深层次机制、防治糖尿病血管病变有着重要意义。
　　众多的动物与临床试验明确了脂肪组织与心血管病变的密切联系。控制体重可以缓解脂肪组织功能失调，降低心血管病事件风险。糖尿病患者体内的脂肪组织发生功能失调，表现为慢性、亚临床状态的炎症状态。糖尿病状态下失衡的脂肪中发生慢性炎症，同时循环中脂肪相关炎症因子升高。但是脂肪组织中的脂肪因子如何进入循环，如何被靶细胞摄取发挥作用的具体机制尚不明确。
　　细胞微囊泡，是指细胞释放到胞外，大小不一的膜性小泡，其中含有丰富的蛋白质、核酸与脂质。广泛存在于血液、尿液、腹水、支气管肺泡灌洗液、唾液及母乳等众多体液中。它能被内皮细胞、巨噬细胞、血小板甚至足肿瘤细胞分泌和摄取，从而介导细胞与细胞、组织与组织间的信号通讯。依据微囊泡的大小与产生机制不同可以分为外泌体(Exosome，直径30-100nm)、微粒（Microvesicle，100-1000nm）、凋亡小体(Apoptosis body，1-5μm)等。其中Exosome的作用研究最为深入，已有研究发现Exosome涉及抗肿瘤免疫、肿瘤逃逸、组织修复、神经细胞间通信、病原体免疫、胚胎发育与表观遗传调控等多种生命与疾病过程。
　　新近的研究发现Exosome在心血管稳态中具有重要的作用，研究发现脂肪组织内的脂肪细胞可以主动分泌Exosome(脂肪组织来源Exosome，adipose derived Exosome， ADE)，ADE不仅参与巨噬细胞激活、介导组织纤维化、帮助组织修复，还参与炎症过程。但是糖尿病状态下发生炎症的脂肪组织释放的ADE的具体成分是什么？主要功能是什么？参与哪些生命与疾病过程？这些问题尚不清楚。
　　为探索上述问题，我们提取了正常小鼠、肥胖型糖尿病小鼠（ob/ob小鼠）与非肥胖型糖尿病小鼠（STZ+高脂喂养诱导）的脂肪组织分泌的ADE，以及临床糖尿病与非糖尿病患者的ADE，运用多种手段检测其Exosome表征与理化特征，质谱分析糖尿病小鼠ADE的蛋白组成，运用生物信息学的方法分析其蛋白功能与参与的生命过程，为进一步探索糖尿病状态下脂肪组织分泌的ADE与心血管疾病的关系打下基础。
　　2研究目的
　　1)探讨分离纯化ADE的方法与策略;
　　2)分析糖尿病来源ADE的蛋白质构成;
　　3)运用生物信息学的方法分析ADE蛋白的功能。
　　3实验方法
　　1)收集糖尿病与非糖尿病小鼠及人的内脏脂肪组织分泌的上清;
　　2)采用差速离心法、密度梯度超速离心法（重水蔗糖垫法）与沉降剂(ExoQuick)方法分离纯化ADE;
　　3)通过检测标志蛋白、标志酶、总蛋白、动态光散射与电镜形态测定上述分离纯化方法的得率与纯度;
　　4)使用质谱分析检测ADE中蛋白成分;
　　5)比对数据库，分析ADE中Exosome标志蛋白的组成与脂肪因子富集情况;
　　6)使用生物信息学方法分析ADE中蛋白功能;
　　7)Western blotting与ELISA的方法比较非糖尿病与糖尿病个体ADE中富集的脂肪因子，并统计相关的临床影响因素;
　　8)免疫金标及组分Western blotting分析ADE中脂肪因子的空间定位。
　　4实验结果
　　1) ADE分离与纯化方法的比较
　　(1)得率比较:比较差速离心法、重水蔗糖垫法与沉降剂Exoquick法分离提纯的Exosome，结果显示差速离心法获得最多的总蛋白、Exosome标志蛋白CD63与标志酶Acetyl-CoA，沉降剂Exoquick法次之，重水蔗糖垫法相对最少;
　　(2)纯度比较:以标志酶Acetyl-CoA与总蛋白比率作为纯度参数比较不同方法提取纯化的ADE，结果显示差速离心法获得的ADE纯度最高;同时透射电镜观察纯化的ADE样品，发现差速离心法获得的ADE背景较低，而沉降剂法获得的ADE背景中有中高电子密度的颗粒物污染;
　　(3)粒径大小比较:差速离心法得到Exosome直径在30-100nm之间，各个批次之间直径差异较小;重水蔗糖垫法得到的Exosome直径多为30-120nm，但有部分批次的样品存在100-400nm的颗粒;沉降剂Exoquick法得到15-130nm的Exosome，但是各批次的直径差异较大;
　　(4)孵育时间对脂肪细胞释放ADE数量的影响:比较孵育脂肪组织15min、30min、60min，2h，3h与6h后差速离心法分离提取的ADE，结果显示孵育6h能稳定获得最多的总蛋白、Exosome标志蛋白CD63与标志酶Acetyl-CoA;
　　(5)孵育时间对脂肪细胞释放ADE纯度的影响:结果显示孵育6h获得的ADE中Acetyl-CoA与总蛋白比率与孵育15min、30min、60min，2h，3h得到ADE无显著差异;
　　2)糖尿病ADE蛋白成分的分析
　　(1)糖尿病ADE蛋白质谱结果:获得34901个肽段，比对数据库，阈值设定为p＜0.00575，ADE中鉴定出1331种蛋白;比对Exosome特征蛋白数据库ExoCarta—Top100 protein，ADE中含有87种Exosome特征蛋白，仅未检测到VCP, HSPA5, SLC3A2, CCT2, TUBA1B, ANXA6, TUBA1C, TFRC,HIST2H4A，ITGA6，HIST1H4B，YWHAH等13个曾报道过的特征蛋白;
　　(2)糖尿病ADE蛋白中脂肪因子的种类:ADE中鉴定到Dipeptidyl peptidase4，Retinol-binding protein, Resisitin, Pigment epithelium derived factor,Adiponectin五种脂肪因子，其中DPP4肽段匹配最多，总匹配数位49，重点匹配为23。
　　(3)糖尿病ADE蛋白功能聚类:使用David对鉴定的蛋白进行功能聚类，结果显示ADE中的蛋白主要功能为Tricarboxylic acid cycle，Proteasome core complex，GTP binding, Oxidoreductase activity, Annexin, Contractile fiber, Protein importinto nucleus, Regulation of T cell mediated cytotoxicity, Neutral lipid metabolicprocess, Nucleoside binding, Positive regulation of adaptive immune response,Glycogen metabolic process, Mitochondrial respiratory chain complex I,Nicotinamide nucleotide metabolic process, Lipoic acid binding, ATP synthesiscoupled proton transport(P＜0.007)。
　　(4)糖尿病ADE蛋白Pathway聚类:主要涉及蛋白结合、核酸结合与钙离子通道等功能。
　　(5)非糖尿病与糖尿病的小鼠（WT vs.ob/ob和WT vs.STZ-WT），人（无vs.合并糖尿病的患者）的内脏脂肪ADE中DPP4含量比较:与WT小鼠相比，ob/ob小鼠的ADE中DPP4明显升高。为了明确DPP4在其他糖尿病小鼠模型ADE中的表达情况，排除瘦素基因的影响，我们构建了STZ诱导的糖尿病小鼠模型。与WT小鼠相比，STZ诱导的WT小鼠ADE中DPP4同样明显升高。
　　(6)为了探索其临床相关性，我们收集了19例人体大网膜内脏脂肪组织（9例糖尿病，10例正常对照），使用上述方法分离纯化得到人源ADE。ELISA结果显示糖尿病患者ADE中DPP4明显高于正常对照。
　　(7) ADE中DPP4与脂肪细胞大小，空腹血糖的关系:为探索影响ADE中DPP4含量的临床因素，我们采集了上述19例研究对象的临床及实验室检查资料，其中脂肪细胞大小(r=0.60，p＜0.01)，空腹血糖(r=0.50，p＜0.01)与ADE中DPP4的含量成正相关关系。而ADE中DPP4含量与性别、年龄、体重、吸烟史、饮酒史、冠心病史、高血压史、糖尿病史、糖尿病病程、TC、TG、HDL-C和LDL-C无明显线性关系。
　　(8)糖尿病ADE膜组分与内含物组分中DPP4含量比较:DPP4可裂解为胞内-跨膜段与胞外段两部分。胞外段为DPP4可溶的形式，可以直接释放到体液中，为明确ADE中DPP4的具体存在形式，我们联合碱与超声方法破碎ADE，并分离ADE膜组分与内含物组分，Western blotting检测两者中DPP4含量。结果显示内含物组分中不含DPP4。
　　(9)糖尿病ADE DPP4原位金标电镜观察:为了在原位显示DPP4在ADE的表达，我们使用免疫金标ob/ob ADE，电镜结果显示，对照ADE无金颗粒结合，而DPP4抗体标记组的ADE膜表面有明显的金颗粒结合。
　　5结论
　　1)差速离心法是稳定获得高纯度与高得率ADE的合适方法;
　　2)糖尿病ADE中富集DPP4等脂肪因子，其含量与空腹血糖水平和脂肪细胞大小成正相关关系;
　　3)糖尿病ADE负载的蛋白可能参与能量代谢、物质合成、免疫调节等多种生物学过程。