Progranulin在股骨头坏死软骨退变及骨肉瘤中的作用及机制研究

股骨头坏死(Osteonecrosis of femoral head，ONFH)是骨关节系统的常见病、多发病，病变早期患者以髋关节疼痛及活动障碍为主要临床表现，随着病情逐渐加重，逐渐累及关节间隙使间隙变窄、致髋关节关节炎、甚至股骨头变形塌陷、关节融合，给患者生活带来巨大影响，后期往往需要行髓心减压、关节融合、关节置换等手术治疗。髋关节外伤股骨颈骨折、大量摄入酒精、长期大量应用糖皮质激素、减压病等是股骨头坏死的常见病因，但其确切的病理发病机制尚不完全清楚，血管损伤血运障碍学说、脂质代谢紊乱学说等是研究较多的关于发病机制学说，随着基因分子生物学的发展，对疾病的认识逐渐向微观方向发展、逐渐深入到分子基因水平。前期研究发现在坏死的股骨头骨质及关节液中多种炎症因子高表达，同时发现在股骨头坏死患者关节液及关节软骨中发现软骨降解产物，软骨退变被证实在股骨头坏死病变早期已经开始发生，说明股骨头坏死病变是一个整体，涉及到股骨头骨质、关节软骨、关节液以及相关的炎症因子，炎症反应和软骨退变参与了疾病的发生发展，但关于软骨退变如何发生、炎症反应如何起作用尚不明确。为了进一步加深对股骨头坏死病理机制的认识，应重视软骨退变在疾病进展中的作用，并研究软骨退变及炎症反应在病变过程中作用机制。
　　骨肉瘤(Osteosarcoma)是骨关节系统最常见的原发性恶性肿瘤，青少年患者多发，每年每百万人中约有6-8个新发病患者。由于肿瘤恶性程度高、易复发、易耐药、易早期发生远处转移等特点，使治疗效果不理想很难令人满意。1970年以前对骨肉瘤的治疗以截肢作为最常用的治疗方案，但仅有不到10％的5年生存率。目前国际上通用的标准的骨肉瘤治疗方案是:术前新辅助化疗尽量杀死骨肉瘤细胞并消灭微转移灶、手术尽量完整彻底切除肿瘤、术后化疗，治疗效果有了明显提高，但是自上世纪70年代以来五年生存率一直维持在60％-70％左右，未有明显改善，因此为了改善骨肉瘤患者的预后、提高患者的生活质量迫切需要研制新的药物和方法。研究发现，在肿瘤的发生、发展及侵袭转移中，生长因子及其激活的信号通路发挥了较大的作用，因此生长因子及其激活的信号通路可以作为研究骨肉瘤治疗的新思路。
　　Progranulin(PGRN)作为一种自分泌生长因子，具有多种生物功能，表达于多种组织内如上皮组织、神经组织、软骨组织及多种肿瘤组织内，研究证实:PGRN在软骨细胞的发育、分化、增殖中起到重要作用;据报道，PGRN在多种肿瘤组织内高表达，并对肿瘤的发生、进展、局部及远处转移起到重要作用。本研究目的是:检测股骨头坏死患者股骨头软骨及骨肉瘤中PGRN的表达，并研究PGRN在股骨头坏死软骨退变及骨肉瘤中作用及机制，希望能够发现新的诊断及治疗靶点，以改进诊断治疗方案，本研究首次对PGRN在股骨头坏死软骨及骨肉瘤中的表达及作用进行研究。
　　本研究分为两部分:第一部分主要研究PGRN在股骨头坏死软骨退变中所起到的作用及机制;第二部分主要研究PGRN在骨肉瘤中的表达情况，以及PGRN对骨肉瘤细胞生长增殖、侵袭、迁移所起的作用及作用机制。
　　第—部分:股骨头坏死软骨退变中PGRN表达及在病交中所起到的作用及机制研究目的:本研究的目的在于研究PGRN在股骨头坏死软骨及血清中的表达情况，探讨其在股骨头坏死软骨退变中的作用及其作用机制。
　　研究方法:分别收集股骨头和血清标本，股骨头坏死患者作为实验组、股骨颈骨折患者作为对照组，分别应用免疫组化、蛋白质免疫印迹实验(Western-blot技术)、聚合酶链式反应(RT-PCR)检测PGRN在软骨中的表达、利用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清中PGRN的浓度;体外实验:提取并培养股骨头坏死软骨细胞并加入PGRN刺激，检测aggrecan和collagenⅡ等软骨合成代谢产物的表达情况，及信号通路ERK1/2的激活情况。
　　研究结果:1.经免疫组化实验检测、蛋白质免疫印迹实验(Western-blot)检测及聚合酶链式反应(PCR)检测示:股骨头坏死组软骨中PGRN的表达较股骨颈骨折组明显增加，酶联免疫吸附试验(ELISA)实验示:实验组血清中PGRN浓度高于对照组;2.经免疫组化和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测示:肿瘤坏死因子（TNF-α）在股骨肉坏死关节软骨及关节液中表达高于对照组;3.重组PGRN能够拮抗肿瘤坏死因子(TNF-α)刺激所导致的软骨分解代谢4.重组PGRN能够激活信号通路ERK1/2，促进软骨细胞合成aggrecan和collagenⅡ，对软骨细胞合成代谢起促进作用，在股骨头坏死软骨退变中起到一定的保护作用。
　　研究结论:PGRN能够改善软骨细胞的合成代谢、抑制分解代谢，在股骨头坏死软骨退变病理进程中起到软骨保护作用，此次研究加深了股骨头坏死病变过程中对软骨退变及PGRN对软骨退变保护作用的认识。
　　第二部分:骨肉瘤中PGRN的表达，PGRN在骨肉瘤细胞生长、侵袭、迁移中的作用及作用机制。
　　研究目的:本研究的目的在于研究PGRN在骨肉瘤细胞、病人血清及骨肉瘤组织中的表达情况，并研究其对骨肉瘤细胞生长、侵袭及迁移的作用及相关机制。研究方法:收集骨肉瘤及瘤旁组织标本，经免疫组化实验、蛋白质免疫印迹实验(Western-blot)、聚合酶链式反应(RT-PCR)实验检测组织中PGRN的表达;收集骨肉瘤患者及正常志愿者血清，经酶联免疫吸附试验(ELISA)对比两组血清中PGRN浓度;经细胞免疫荧光实验检测PGRN在骨肉瘤细胞中的是否表达，PGRN对骨肉瘤细胞活性、增殖的影响，是通过CCK-8实验、流式细胞周期实验检测的;对骨肉瘤细胞运动、侵袭及迁移的影响是通过划痕实验及Transwell实验来检测的:利用重组PGRN刺激骨肉瘤细胞并检测MMP-2及相关信号通路Akt及mTOR的表达激活情况。
　　研究结果:1.对两组组织进行免疫组化染色，提取两组组织总蛋白进行蛋白质免疫印迹实验(Western Blot)，提取两组RNA进行聚合酶链式反应(RT-PCR)结果表明:骨肉瘤组织中PGRN表达明显高于瘤旁组织;收集两组患者血清进行酶联免疫吸附试验(ELISA)结果表明:血清中PGRN的浓度实验组高于健康对照组;对骨肉瘤HOS、Sao-2细胞系进行免疫荧光染色，染色证明PGRN在以上两种骨肉瘤细胞系表达;2.通过CCK-8实验、划痕实验、流式细胞周期检测试验及Transwell实验检测发现:PGRN在骨肉瘤细胞的生长增殖、侵袭及迁移过程中起重要的促进作用;3.随着PGRN浓度的增高其促进骨肉瘤细胞中MMP-2的表达的作用逐渐增强，PGRN可以使Akt及mTOR信号通路快速磷酸化激活。
　　研究结论:研究中我们初次证实PGRN高表达于骨肉瘤织及患者血清，证实骨肉瘤细胞系中表达PGRN，发现PGRN可以激活Akt及mTOR信号通路，可能通过活化以上信号通路对骨肉瘤细胞的生长增殖、侵袭迁移起到促进作用，本研究增加了对骨肉瘤发生、发展、转移等的认识，为骨肉瘤的诊断治疗的提供了新思路。