阳离子抗菌肽在大肠杆菌及酿酒酵母中高效表达体系构建

阳离子抗菌肽G13是Granulysin中，含19个氨基酸残基肽段，对细菌有抑菌活性而对动物细胞无毒，有重要研究价值。抗菌肽的生产以基因工程为主要手段，目前基因工程表达抗菌肽的体系主要包括真核和原核表达体系，其中原核表达系统以大肠杆菌表达体系为主。由于抗菌肽对宿主细胞的毒性及自身易被蛋白酶降解，因此原核表达主要采用融合表达技术，而切割融合头一直以来都是抗菌肽融合表达的一个重步骤。酶法切割成本很高;溴化氢有剧毒，用其溴化氰切割会给科研和生产带来诸多不便。我们在pThiohisA-G13载体中的融合头与抗菌肽之间添加Asp-Pro酸敏感位点，去除原来的Met（溴化氢切割位点）构建了pThiohisA-G13-C质粒，将其转化于大肠杆菌BL21(DE3)中，经IPTG诱导获得了重组蛋白的可溶性表达。诱导表达后的菌体经PB缓冲液悬浮后用高压均质机在80Mpa下进行破碎，其上清加入13％的乙酸于50℃孵育72h，成功地切割了融合蛋白获得了重组G13结构域。同时还研究了不同质量分数的硫酸铵及不同浓度的TCA溶液除杂蛋白效果。水解上清经过硫酸铵和TCA分级沉淀，用PB缓冲液溶解经阳离子交换层析，得到纯化的阳离子抗菌肽G13结构域。Tricine-SDS-PAGE电泳结果显示，纯化的G13在4.1 kDa处呈单一条带，经bandscan扫描G13结构域纯度达到98％。质谱分析证明了纯化蛋白为G13结构域，G13结构域的圆二色谱分析表明，其二级结构主要以β-折叠及无规卷曲形式存在，当用3％SDS或接近其等电点的缓冲液来模拟细胞膜环境时，出现了α-螺旋结构。琼脂糖扩散法检测表明重组阳离子抗菌肽G13对大肠杆菌DH5α及枯草芽孢杆菌均具有抑菌活性。
　　本实验同时对抗菌肽真核表达进行了研究，成功地对pYES2质粒的GAL1启动子进行改造，去除葡萄糖抑制效应相关的负调控基因，构建了牛乳铁蛋白肽(Lactoferricin Bovine，LfcinB)的真核表达质粒M-pYES2-α-LfcinB，将其转化到大肠杆菌DH5α中进行扩增。提取纯化重组质粒并将其电击转化入酿酒酵母宿主菌INVSc1中，通过尿嘧啶缺陷筛选培养基筛选阳性克隆，接种于尿嘧啶缺陷选择培养基摇瓶培养，添加半乳糖诱导表达目的蛋白。收集浓缩诱导后的蛋白进行Trincine-SDS-PAGE电泳检测，证实目的蛋白的存在。此外，还研究了不同诱导温度及时间对LfcinB的影响，实现了LfcinB在酿酒酵母中的高效、快速分泌表达，并在很大程度上解决了葡萄糖抑制效应问题，获得有活性的重组抗菌肽。首次在4h时就检测到LfcinB的抑菌活性，在24h活性达到最大，为进一步研究葡萄糖抑制效应、LfcinB的生物功能及应用开发奠定了基础。