葡萄茎尖超低温保存及超低温疗法脱毒研究

葡萄(Vitis)是世界范围内最具经济价值的果树之一，城市化、工业化、土壤盐碱化和沙漠化等原因导致葡萄许多野生种与栽培种濒临灭绝。建立高效、简易的种质资源长期保存技术能有效地保护种质资源的多样性。超低温保存是目前植物种质资源长期保存最为理想的方法。病毒病是制约葡萄与葡萄酒产业发展的主要因素之一。栽培无毒苗是生产上防治病毒病害最为有效的措施。生产无毒苗是栽培无毒苗的核心技术。近年来建立的超低温疗法，为葡萄无毒苗生产提供了一种新技术。本研究以葡萄(Vitis)试管苗为试材，建立了茎尖小滴-玻璃化法超低温保存体系，为葡萄种植资源超低温库的建立提供了高效、广谱的超低温保存方法。建立了超低温疗法，有效的脱除了葡萄卷叶相关病毒-3(Grapevine leafroll-associated virus3，GLRaV-3)，为葡萄脱毒苗的生产提供了核心技术。同时，试管指示植物法、微样直接RT-PCR、免疫组织化学定位病毒检测为脱毒和病毒检疫提供技术支撑。本研究主要结果如下:
　　1.通过优化影响葡萄茎尖超低温保存的关键因素，建立了简易、高效、光谱的葡萄茎尖小滴-玻璃化法超低温保存体系。含5-6片叶原基的腋芽(尺寸约1.0 mm)取自8周苗龄欧洲葡萄‘赤霞珠’(Vitis vinifera‘Cabemet Sauvignon’)试管苗，在预培养基(0.3 M蔗糖+0.16μM还原型谷胱甘肽+0.14μM L-抗坏血酸，pH=5.7)上暗培养3d。加载液（2 M甘油+0.4 M蔗糖）常温处理20 min，再用1/2浓度植物玻璃化溶液(PVS2)和全浓度PVS2冰上分别处理30 min和25-50 min，然后将茎尖放置于铝箔条上的PVS2小滴(2.5μL)中，直接投入液氮中保存。保存后的携带茎尖的铝箔条迅速转移到卸载液(1.2 M蔗糖)中常温解冻20 min，培养于含0.6 M蔗糖的恢复培养基中恢复24 h。再将茎尖转移至再生培养基中获得再生植株。再生培养基含1/2 MS+0.5 mg L-1 BA+7 gL-1琼脂，培养6周后可获得正常发育的植株。将该技术应用于其他7个葡萄基因型，包括5个欧洲葡萄和2个华东葡萄(V.pseudoreticulata)，获得50.5％的平均再生率。再生率最高的是‘赤霞珠’(71.7％)，最低的是‘白河35-1’(V.pseudoreticulata‘Baihe35-1’，21.7％)。谷胱甘肽和抗坏血酸加入预培养基，解决了超低温保存后不再生的问题。比较腋芽着生部位和芽的类型对超低温保存再生率的影响，发现对于葡萄，腋芽比顶芽更适合用于超低温保存。通过组织学定位观察成活细胞的分布和数目探究PVS2处理不同时间对超低温保存成活率和再生率的影响，揭示超低温保存的茎尖成活模式。ISSR(inter-simple sequence repeat，内部简单序列重复)和RAPD(random amplificationof polymorphic DNA，随机扩增片段长度多态性)技术用于检测葡萄茎尖超低温保存后得到的再生植株的遗传稳定性，未发现异常条带。超低温保存后的再生苗经过7次继代培养，其营养生长逐渐优于普通组培苗。
　　2.建立茎尖小滴-玻璃化法超低温疗法以脱除GLRaV-3。从6周苗龄的‘赤霞珠’试管苗上取包含1个腋芽的单茎段，每个单茎段长约1.0 cm，培养于1/2 MS培养基中促进顶芽萌发。2周后，取项芽(1.0 mm，含5-6片叶原基)，置于预培养基(0.3 M蔗糖+0.16μM还原型谷胱甘肽+0.14μM L-抗坏血酸的)上暗培养3d。用加载液常温处理20 min，再用1/2 PVS2冰上处理30 min，之后在PVS2中处理不同75 min。然后将茎尖转移至铝箔条上的PVS2小滴(2.5μL)中，直接投入液氮中。处理后的茎尖用卸载液常温处理20 min，培养于恢复培养基中恢复24 h。再将茎尖转移至再生培养基中培养6周后可获得正常发育的脱毒苗。超低温疗法对GLRaV-3的脱毒率为100％，茎尖大小或PVS2处理时间不影响脱毒率。利用免疫组织化学法观察GLRaV-3在茎尖中的分布，GLRaV-3在顶端分生组织和第1-4片叶原基没有分布，在距离顶端分生组织约0.2 mm处和第5片叶原基及更老组织有分布。超低温疗法后，第5片叶原基的细胞全部死亡。超低温疗法处理后的茎尖成活细胞分布，结合病毒定位结果，解释了超低温疗法能够脱除GLRaV-3的原因。
　　3.优化、建立了微样直接RT-PCR(microtissue direct RT-PCR)法、免疫组织化学定位、试管指示植物和微嫁接四种技术对GLRaV-3进行检测和定位。以欧洲葡萄‘赤霞珠’为试材检测GLRaV-3时，微样直接RT-PCR使用注射针刺穿植株叶片或茎段，将针头剪断，置于反转录反应混合物PCR管中，加盖等待15 min，然后进行PCR扩增。该方法成功的应用到超低温疗法脱除GLRaV-3的脱毒苗检测，与RT-PCR检测结果比较，没有差异。免疫组织化学法定位GLRaV-3在组织中的分布，并成功的应用到葡萄茎段、茎尖组织的GLRaV-3定位，进一步证实GLRaV-3是维管束限制性病毒，并且不能够侵染到顶端分生组织和幼嫩的第1-4片叶原基。试管指示植物法，将感染GLRaV-3的试管苗茎段（约3 cm长，带2-3片叶）培养在含150 mM NaCl胁迫培养基中，最早在5d即可观察到典型的卷叶病症状:叶片红色、叶缘向内卷曲，培养4周时有86％的症状显示比例。将其应用到其他三个基因型上，150 mM NaCl在杂交砧木‘6-12-2’(V.pseudoreticulata‘Baihe-35-1’×V.vinifera‘Carinena’)上显示症状最早，为4d，4周时症状占比为100％;在‘巨峰’显示症状最晚最轻，为8d，显示症状占比为70％。