斜卧青霉木质纤维素酶系的合成调控研究

目前，木质纤维素降解酶系己广泛地应用于能源、纺织、印染、造纸、洗涤、食品、饲料、酿酒等多个行业，显示了巨大的市场潜力。随着资源短缺、环境污染和能源危机的加剧，利用廉价的木质纤维素类可再生资源生产液体燃料和生物化工产品，不仅能够节粮代粮，缓解能源危机，同时还可以保护环境，促进全球经济的可持续发展。但木质纤维素酶系的产量和酶的比活力低，以及酶系组成不合理一直是制约木质纤维素酶系实际应用的重要原因。就我们的理解，木质纤维素、生物质降解酶和微生物这三个要素构成一个动态互作系统，深入研究每个要素及其之间的关系是提高生物质能源的生产能力、缓解能源危机的便捷之路。在这三个要素中，人们对微生物的关注主要集中于优良菌株的选育和改良，包括菌株的筛选和诱变。目前用到的方法有常规理化诱变、基因组重排、细胞融合和分子插入诱变等，但这些方法都属于随机的菌株改良策略，不仅工作量大，而且没有针对性。具有针对性的菌株的定向工程改良近来受到人们的重视，但其前提是弄清酶的合成调控机制。因此，研究微生物木质纤维素酶系的合成与调控不仅具有重要的理论意义，而且有助于通过改进营养策略和生物过程设计或通过定向工程改良，提高酶的生产和应用。 研究表明，不同来源的木质纤维素酶系的酶系组成及合成调控机理往往存在差异，而目前国内外的研究主要围绕木霉和曲霉的合成调控的，对其它丝状真菌尤其是青霉木质纤维素酶系合成调控的研究较少。本论文从改进木质纤维素、生物质降解酶和微生物这一动态互作系统的角度出发，以我们实验室选育的斜卧青霉为实验材料，研究了其木质纤维素酶系的合成调控机理，丰富了对相关领域的认识，同时为菌株的定向工程改良和生物过程设计，提供了可靠的实验数据和理论依椐。本论文的主要研究结果如下： 1、克隆了青霉木质纤维素酶系合成调控因子基因creA与acel，初探了菌株JU-A10的抗降解物阻遏突变机理利用TAIL-PCR和RT-PCR技术克隆了青霉木质纤维素酶系合成调控因子编码基因creA与acel。creA基因全长为1251 bp，不含有内含子，编码417个氨基酸。CREA蛋白理论分子量和等电点分别为44956,072 Da和pI 9,735。acel基因全长为2836 bp，含有3个内含子，大小分别为129 bp、165 bp和58 bp。acel基因共编码827个氨基酸。ACE I蛋白的理论分子量和等电点分别为89871.29 Da和pI 5.685。转录分析表明斜卧青霉的creA与acel基因是组成性表达的。通过对斜卧青霉114-2及其突变菌株JU-A10的creA与acel基因的序列和转录比较发现，两菌株的creA与acel基因的序列和转录情况相同。因此，菌株JU-A10的抗降解物阻遏特征不是由于碳源代谢抑制因子CRE A或．ACE I的突变而引起的。结合已有的知识和分析，菌株JU-A10的脱阻遏特征应该是由产能代谢发生了变化引起的。 2、揭示了斜卧青霉基础性与诱导性纤维素酶的组成及区别通过对诱导与阻遏条件下斜卧青霉胞外纤维素酶活力测定和活性染色进行分析，发现斜卧青霉的胞外存在基础性纤维素酶，基础性纤维素酶由内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶组成。其中基础性与诱导性表达的内切葡聚糖酶组分是不同的，部分诱导性内切葡聚糖酶组分只有在诱导条件下才合成。转录分析表明，斜卧青霉的主要纤维素酶基因cbh1、cbh2、egll、egl2和bgl1均存在低水平的基础性转录，除了β-葡萄糖苷酶和外切葡聚糖酶外，只有部分内切葡聚糖酶基因转录后进行了翻译并分泌到胞外，这部分组分才是真正的基础性内切葡聚糖酶。 基础性内切葡聚糖酶由4个组分组成，分子量大小分别为43 kDa，39 kDa、36 kDa和34 kDa。其中34 kDa蛋白是最先表达的关键基础性内切葡聚糖酶。对纯化的34 kDa基础性内切葡聚糖酶和45 kDa诱导性内切葡聚糖酶的性质比较显示，斜卧青霉中基础性的与诱导性的内切葡聚糖酶不是由同一基因编码。 3、纯化了斜卧青霉的主要纤维素酶组分并构建了其肽质量指纹图谱库利用多种色谱分离技术相结合方法从斜卧青霉114-2发酵液中分离得到了1个纯β-葡萄糖苷酶和6个内切葡聚糖酶组分。β-葡萄糖苷酶的分子量大小为124kDa。其对底物水杨素的Km值为0.0007 mol/L。β-葡萄糖苷酶最适作用温度和pH分别为65℃和pH 4-5。6个内切葡聚糖酶的分子量大小分别约为100 kDa、60 kDa、49 kDa、45 kDa、34 kDa和24 kDa。其中45 kDa和34 kDa内切葡聚糖酶达到了电泳纯，二者对底物CMC-Na的Km值分别为0.7793 g/L 和0.8365g/L。45 kDa与34 kDa内切葡聚糖酶的最适作用温度均为55-60℃，最适作用pH分别为pH 4.5和pH 5.0。这2种内切葡聚糖酶及β-葡萄糖苷酶在50℃以下及偏酸性的条件下能保持较好的稳定性。通过将纯化的纤维素酶进行SDS-PAGE后胶内酶解和MALDI-TOF质谱分析，并结合对斜卧青霉纤维素酶基因或基因片段编码蛋白序列的分析，构建了斜卧青霉纤维素酶的肽质量指纹图谱(PMF)库。本PMF库中包含1种β-葡萄糖苷酶、6种内切葡聚糖酶和2种外切葡聚糖酶的肽质量指纹图。 4、建立了斜卧青霉胞外差异蛋白组研究技术体系通过条件优化，建立了稳定可靠的斜卧青霉胞外蛋白的双向电泳实验方法。比较诱导与阻遏条件下斜卧青霉114-2胞外蛋白的双向电泳图谱发现，在诱导与阻遏条件下共同存在的蛋白点约23个，而在诱导条件下，斜卧青霉胞外蛋白的种类和数量较阻遏条件下明显增多，多出的蛋白点近40个。 我们比较了三种蛋白鉴定方法：一种是采用MASCOT搜索引擎对蛋白的PMF在NCBInr数据库中检索；第二种是通过软件GPMAW 6.0或手工方法对蛋白的PMF在我们构建的斜卧青霉纤维素酶的PMF数据库中检索。第三种是采用MASCOT搜索引擎对串联质谱结果在NCBInr数据库中检索。通过比较，验证了通过纯化蛋白构建数据库用于蛋白鉴定的方法可行性。采用这种方法，我们共鉴定出2个β-葡萄糖苷酶、13个内切葡聚糖酶。其中2个β-葡萄糖苷酶和2个内切葡聚糖酶是基础性表达的。 5、分析了麦麸中各组分对斜卧青霉生物质降解酶系合成的影响，找出了促进纤维素酶合成的关键因子之一是可溶性的纤维类寡糖在不同成分含量的碳源培养条件下，通过测定斜卧青霉菌体生长量和胞外生物质降解酶活力发现：麦麸中的淀粉可以诱导斜卧青霉淀粉酶的合成，但不能提供菌体生长需要的生长因子，过量时会抑制纤维素酶与木聚糖酶的合成。麦麸中的蛋白能帮助斜卧青霉生长，但添加过量蛋白也会抑制斜卧青霉纤维素酶、木聚糖酶与蛋白酶的合成。麦麸中的木聚糖可以诱导斜卧青霉纤维素酶与木聚糖酶的合成，但对纤维素酶的诱导能力明显低于对木聚糖酶的。研究表明促进斜卧青霉纤维素酶合成的关键因子主要在麦麸汁中。通过对麦麸汁的成分分析及添加纤维寡糖实验，证明了麦麸中促进斜卧青霉纤维素酶合成的关键因子之一是其可溶性成分中的纤维类寡糖。因此，测定和控制培养基中淀粉、蛋白和纤维类寡糖含量是稳定和提高斜卧青霉纤维素酶产量的重要措施。