CYP4A11和CYP4F2基因多态性与原发性高血压和冠心病的相关研究

研究目的：
　　 高血压(Hypertension)是一种以动脉血压持续升高为主要特征的慢性疾病，其病理过程常涉及动脉血管壁增厚、心肌纤维化、左室肥大和肾血管硬化等，可引起高血压靶器官的损害，是脑卒中、心肌梗死、充血性心力衰竭和高血压性肾病发病、死亡的主要危险因素。高血压根据病因可分为原发性和继发性两类，继发性高血压是由某些确定的疾病或病因（如肾脏疾病、内分泌疾病、心血管病变、颅脑病变等）引起的血压升高，约占所有高血压的5％;在绝大多数患者中，高血压的病因不明，称为原发性高血压(essentialhypertension，EH)，约占全部高血压患者的95％以上，通常简称为高血压。冠状动脉粥样硬化性心脏病指冠状动脉粥样硬化使血管狭窄或阻塞，或（和）因冠状动脉功能性改变（痉挛）导致心肌缺血缺氧或坏死而引起的心脏病，简称冠心病(coronaryheartdisease，CHD)，亦称缺血性心脏病，包括心绞痛和心肌梗死。冠心病是动脉粥样硬化导致器官病变的最常见类型，也是严重危害人民健康的常见病。
　　 世界卫生组织(WHO)的调查报告显示，冠心病至今仍是人类死亡的主要原因之一，且发病率逐年上升，其治疗尤其是预防显得极为重要。肥胖、血脂异常、高血压、糖尿病、吸烟、饮酒等一些传统危险因素与冠心病的发生有关，其预防主要是对各种危险因素进行控制，而原发性高血压是冠心病的重要危险因素之一，其发生与冠心病密切相连，有效预防高血压也因此备受关注。高血压的传统危险因素包括高盐饮食、抽烟、饮酒和长期精神紧张等。EH和CHD都是遗传和环境因素共同作用的结果，是多基因相关疾病，具有明显的家族聚集性，遗传因素在其发病起重要作用。随着分子生物学的迅速发展及人类基因组计划的进行，寻找心血管疾病易感基因并从基因水平阐明其发病机制成为医学研究的热点。大规模筛查EH和CHD易感人群，实施有效预防措施，对延缓或防止心血管疾病的发生发展具有重要意义。
　　 研究发现内源性花生四烯酸(Arachidonicacid，AA)及其代谢产物对心血管系统具有重要的调节作用。早期研究发现AA主要由环氧化酶(cyclooxygenase，COXs)和脂质氧化酶(lipoxygenase，LOXs)代谢，后研究发现AA还可通过细胞色素P450表氧化酶和ω-羟化酶代谢，分别生成表氧化二十碳三烯酸（epoxyeicosatrienoicacids，EETs）和羟化二十碳四烯酸(hydroxyeicosenoicacids，HETEs)。20-HETE是肾、脑、肠系膜和骨骼肌小动脉的强效收缩剂，在肾脏中又能促进尿钠排泄，具有升压和降压双重作用;还能抑制血管内皮超极化因子介导的冠脉舒张，加重冠脉缺血引起的心肌损伤程度。在不同病理状态下，20-HETE在心血管功能的改变中发挥重要作用，参与EH、CHD等心脑血管疾病的发生发展。
　　 细胞色素P450(cytochromeP450，CYP)是最重要的微粒体混合功能氧化酶，参与体内外众多物质的生物转化，主要包括CYP1～4家族和A、B、C、D、E、F等亚家族。CYP同工酶在肾脏、肝脏、心脏、血管内皮和平滑肌等多种组织中表达，其中CYP4A11和CYP4F2是代谢AA的重要ω-羟化酶，能够代谢AA生产20-HETE。CYP4A11定位于染色体1p33，长约12.57kbp，有12个外显子和11个内含子，编码519个氨基酸;CYP4F2定位于染色体19p13.11，长约20kbp，由13个外显子和12个内含子组成，编码520个氨基酸。CYP4A11和CYP4F2这两个基因的突变位点很多且具有明显的种族差异，在中国汉族人群中普遍存在且具有功能意义的突变主要是-845A＞G(rs9332978)、-296C＞T、8590T＞C（rs1126742）及CYP4F2rs2108622和rs1558139，研究发现这些位点可能与原发性高血压和冠心病具有相关性，但未得出一致结论，因此研究中国人CYP4A11和CYP4F2基因多态性与高血压和冠心病的相关性具有重要的科学价值和广泛的社会效益。本研究通过病例-对照法探讨了CYP4A11的-845A＞G、-296C＞T、8590T＞C和CYP4F2rs1558139基因多态性与中国汉族人群原发性高血压和冠心病的易感性。
　　 研究对象：
　　 所有原发性高血压和冠心病病人均为广州军区广州总医院住院病人，对照组为同期在健康体检中心体检的人。其中原发性高血压患者132例，冠心病患者168例，原发性高血压和并冠心病患者196例，对照者297例。经统计学分析各病例组与对照组年龄、性别、吸烟率、饮酒率等条件具有可比性。
　　 1.EH患者入选标准:
　　 纳入标准:根据美国JNC7及2003年ESH/ESC欧洲高血压指南标准，即坐位时收缩压/舒张压≥140/90mmHg(1mmHg=0.133kPa)，且在第1次诊断后的2个月内3次偶测血压均符合上述标准，已确诊为原发性高血压;或目前正在服用降压药物者。
　　 排除标准:1)继发性高血压;
　　 2)肝肾移植患者或肝肾功能不全者;
　　 3)脑卒中患者;
　　 4)患有恶性肿瘤患者;
　　 5)患有糖尿病、甲状腺疾病等其它内分泌代谢疾病及其它严重的全身性疾病患者;
　　 6)未进行有效避孕的育龄妇女、妊娠和哺乳期妇女。
　　 2.CHD患者入选标准:
　　 纳入标准:经冠脉造影冠脉狭窄≥50％确诊为冠心病者;或有典型心绞痛史患者。
　　 排除标准:1）肝肾移植患者或肝肾功能不全者;
　　 2)脑卒中患者;
　　 3)患有恶性肿瘤患者;
　　 4)患有糖尿病、甲状腺疾病等其它内分泌代谢疾病及其它严重的全身性疾病患者;
　　 5)未进行有效避孕的育龄妇女、妊娠和哺乳期妇女。
　　 3.健康受试者入选标准:
　　 纳入标准:1）排除高血压病和冠心病;
　　 2)血常规、尿常规、凝血功能、胸部X光及血生化、心电图检查正常，无肝肾疾病;
　　 3)无恶性肿瘤;
　　 4)无糖尿病、甲状腺疾病等内分泌代谢疾病及其它严重的全身性疾病;
　　 5)无妊娠计划或正在哺乳的妇女。
　　 研究方法：
　　 实验对象空腹8小时以上，取静脉血采用标准酶比色法测定总胆固醇(totalcholesterol，TC)、甘油三脂(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白胆固醇(lowdensitylipoproteincholesterol，LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(highdensityliproteineholesterol，HDL-C)。另取5ml静脉血置于EDTA-K2抗凝管中，按人血液DNA提取试剂盒操作步骤提取白细胞基因组DNA，所提DNA采用高分辨率熔解曲线(highresolutionmelting，HRM)分析法进行基因型分析。
　　 采用SPSS13.0统计软件对数据进行处理，计量资料用均数±标准差((x-)±s)表示，采用两样本t检验比较高血压组和对照组符合正态分布的计量资料;等位基因频率是否符合Hardy-Weinberg平衡定律和基因型频率和等位基因频率分析应用卡方检验，危险因素分析采用多元logistic回归分析;连锁不平衡分析(LD)用Haploview4.2软件，单体型分析应用R2.14.2分析软件;以双侧P＜0.05为差异有统计学意义。
　　 结果：
　　 1.本研究建立了一种操作简便、成本低、通量高、速度快、灵敏度高、特异性强的高分辨率熔解曲线(highresolutionmelting，HRM)分析法检测CYP4A11-845A＞G、-296C＞T、8590T＞C和CYP4F2rs1558139基因型，该HRM分析法实现了真正的闭管操作，减少交叉污染。
　　 2.采用HRM分析法对328例无血缘关系的原发性高血压患者及297例健康对照者进行CYP4A118590T＞C、-296C＞T、-845A＞G和CYP4F2rs1558139基因分型，结果显示:CYP4A118590C、-296T、-845G和CYP4F2rs1558139T等位基因在中国汉族原发性高血压人群中的分布频率分别为0.265、0.085、0.168和0.291，其中CYP4A11-845G等位基因频率与对照组有差异(P=0.049)。采用logistic回归分析排除传统危险因素的影响，对于全体，CYP4A11-845A＞G显性模型(AAversusAG+GG)仍存在显著性差异(P=0.031)。对于女性，高血压组和对照组CYP4A118590T＞C、-296C＞T和-845A＞G的显性模型(分别为TTversusTC+CC、CCversusCT+TT和AAversusAG+GG)仍然有差异，P值分别为0.032、0.020和0.045;高血压组的T-C-G单体型频率显著高于对照的T-C-A单体型(P=0.016)，其发病率提高了1.909倍。
　　 3.采用HRM分析法对364例（其中196例患有原发性高血压病）无血缘关系的冠心病患者及年龄和性别相匹配的429例（其中132例患有原发性高血压病）健康对照者进行CYP4A118590T＞C、-296C＞T、-845A＞G和CYP4F2rs1558139基因分型，结果显示:CYP4A118590C、-296T、-845G和CYP4F2rs1558139T等位基因在中国汉族冠心病人群中的分布频率分别为0.276、0.076、0.176和0.372。采用logistic回归分析排除传统危险因素的影响，对于全体，冠心病组和对照组的CYP4A11-845A＞G显性模型(AAversusAG+GG)仍存在显著性差异(P=0.026)。对于女性，冠心病组和对照组的CYP4A11-845A＞G显性模型(AAversusAG+GG)存在显著性差异(P=0.045)。冠心病组和对照组CYP4A11-845A＞G的基因型（AAversusAGversusGG）存在差异(P=0.034)，但显性模型(AAversusAG+GG)差异则消失(P=0.125)。
　　 冠心病组和对照组都排除高血压病患者后，采用logistic回归分析排除传统危险因素的影响，对于全体，冠心病组和对照组的CYP4A11-845A＞G显性模型(AAversusAG+GG)仍存在显著性差异(P=0.039);对于女性，冠心病组和对照组CYP4A11-845A＞G的基因型（AAversusAGversusGG）差异则消失(P=0.073)。单体型分析结果显示冠心病组的T-C-G单体型频率显著高于对照的T-C-A单体型(P=0.021)，其发病率提高了1.633倍。
　　 结论：
　　 1.CYP4A11-845A＞G位点的AG+GG基因型增加中国汉族原发性高血压病的风险，与男性不相关，与女性相关。
　　 2.CYP4A118590T＞C和-296C＞T基因多态性与原发性高血压的相关性与性别有关，8590TC+CC和-296CT+TT增加女性人群患病风险。
　　 3.CYP4A118590T＞C、-296C＞T和-845A＞G三个SNPs建立单体型，高血压组的T-C-G单体型频率显著高于对照T-C-A单体型，其发病率提高了1.909倍。
　　 4.CYP4A11-845A＞G的AG+GG基因型增加冠心病的患病风险，主要是在女性人群中。
　　 5.冠心病组和对照组都排除高血压这一危险因素后，CYP4A11-845A＞G的AG+GG基因型仍然增加冠心病的患病风险，说明G等位基因可作为冠心病的危险标志基因。
　　 6.排除高血压病例后，冠心病组的T-C-G单体型频率显著高于对照的T-C-A单体型(P=0.021)，其发病率提高了1.633倍。