OPG对破骨细胞活性的影响及其信号转导机制

骨保护素(osteoprotegerin，OPG)是肿瘤坏死因子受体超家族成员，它最主要的生物学作用是抑制体内破骨细胞(osteoclast，OC)的分化、活化，并促进其发生凋亡。临床试验及动物实验表明，重组OPG蛋白和OPG基因治疗等技术手段，对防治人及动物的骨营养不良性疾病具有一定的应用价值。但是关于OPG对OC的调控机制仍不完全清楚，对于OPG相关药物的开发及其普遍运用仍存在诸多困难。本文以原代分离鸭胚OC及诱导获取OC模型为研究对象，在体外培养过程中添加不同浓度OPG，通过形态学鉴定、细胞活性检测、实时荧光定量PCR(QRT-PCR)、蛋白免疫印迹(Western blot)等技术手段，研究OPG对OC分化、活性及凋亡中形态、功能、相关基因及关键信号蛋白的影响。本研究以期为OPG调控OC活性的机理提供理论依据。研究内容如下:
　　1.OPG对破骨细胞分化、活化及凋亡的影响
　　为了研究OPG对体外培养鸭胚OC分化、活化与凋亡的影响，收集23日龄鸭胚骨髓细胞，体外培养过程中分组加入不同浓度OPG进行处理(A组:无因子;B组:30 ng/mL OPG;C组:100 ng/mL OPG)。通过抗酒石酸酸性磷酸酶染色(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)，骨吸收陷窝分析，OC骨架(TRITC标记的鬼笔环肽，TRITC-eonjugated phalloidin)及胞核(Hoechst33258)染色技术，检测TRAP阳性细胞、OC的骨吸收活性以及OC凋亡状态。结果显示，三个实验组中TRAP阳性细胞数、OC的骨吸收活性均在OPG处理7d后达到最高水平。与对照组相比，OPG处理组OC数目及OC的骨吸收活性显著减弱(P＜0.05)，每个时间段骨吸收陷窝净增长面积与OC数目变化趋势一致。OPG能够抑制OC内纤维状肌动蛋白环(Filamentous-actin rings，F-actin tings)的形成，并且能够促进成熟OC内F-actin环的崩解。此外，OPG能够诱导成熟OC发生凋亡，OC的形态及核发生改变。表明OPG能够抑制OC细胞前体分化，促进成熟OC发生凋亡。
　　2.OPG抑制破骨细胞分化成熟的机理
　　为了研究OPG抑制OC分化、活化的分子生物学机理，在无血清培养条件下，采用M-CSF+RANKL联合诱导RAW264.7细胞分化为OC。在培养过程中加入不同浓度OPG（0、10、20、50、100 ng/mL）进行处理。通过TRAP染色，OC内F-actin环染色，骨吸收陷窝分析等技术，研究OPG对OC的分化及活化的影响。此外，通过QRT-PCR技术检测OPG对OC相关基因TRAP、RANK、MMP-9、CAⅡ、Cathepsin K表达量的影响。结果显示，在无血清培养条件下，M-CSF+RANKL能够诱导OC的分化与活化，并能够促进OC分化及活化中TRAP、RANK、MMP-9、CAⅡ、Cathepsin K基因的表达，而OC的分化与活化受到OPG的抑制。
　　3.OPG抑制破骨细胞分化成熟的MAPK信号转导机制
　　为了研究OPG抑制OC分化中的MAPK信号转导机制，采用M-CSF+RANKL诱导RAW264.7细胞分化形成OC，在体外培养不同时间，各组分别添加相应浓度的OPG。各时间点培养结束后收集细胞，提取总蛋白，通过Western blot法检测MAPK信号通路中关键信号蛋白的变化。结果发现，M-CSF+RANKL诱导RAW264.7细胞分化形成OC过程中p38-MAPK、JNK-MAPK、ERK-MAPK三种蛋白的磷酸化水平均上升，在诱导处理15min后p38-MAPK磷酸化水平达最大值，诱导处理30 min后JNK-MAPK、ERK-MAPK磷酸化水平达最大值。不同浓度OPG均能够抑制p38-MAPK、JNK-MAPK、ERK-MAPK三种蛋白的磷酸化水平，且随OPG浓度的增加抑制作用更加明显。表明MAPK信号通路参与调控OC的分化与活化过程，且参与调控OPG抑制OC的分化与活化。
　　4.OPG抑制破骨细胞分化成熟的Ca2+信号转导机制
　　为了研究OPG抑制OC分化中的Ca2+信号转导机制，采用M-CSF+RANKL诱导RAW264.7细胞分化形成OC，在体外培养不同时间，各组分别添加相应浓度的OPG。培养结束后收集细胞，通过流式细胞术检测OC胞内[Ca2+]i，通过Western blot法检测钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）的磷酸化水平。结果发现，M-CSF+RANKL诱导RAW264.7细胞分化形成OC过程中OC胞内[Ca2+]i极显著升高(P＜0.01)，CaMKⅡ激酶磷酸化水平上升，而OPG能够降低OC胞内[Ca2+]i，并下调CaMKⅡ激酶的磷酸化水平。表明Ca2+信号通路参与调控OC的分化与活化过程，且参与调控OPG抑制OC的分化与活化。