植物VKOR氧化还原功能必需氨基酸及抗逆功能的研究

叶绿体是光合作用的重要细胞器，叶绿体内很多蛋白质受氧化还原调控，即通过二硫键/巯基的变换来实现活性的转换。催化叶绿体蛋白二硫键还原的酶类已有深入研究，而寻找催化二硫键形成的酶类一直没有突破进展，近年来植物类囊体膜蛋白维生素K环氧化物还原酶(Vitamin Kepoxide reductase，VKOR)被证实能催化二硫键的形成，因此，也被称为类囊体腔巯基氧化还原酶(Lumen Thiol Oxidoreductase1，LTO1)。研究VKOR的功能及必需氨基酸残基对于阐明叶绿体氧化还原调节机制具有重要理论意义。本实验构建了拟南芥VKOR(AtVKOR)真核表达载体，利用体内、体外测活体系测定了重组表达AtVKOR的活性，利用三维模拟和分子对接预测了AtVKOR必需氨基酸残基，通过定点突变技术探讨了AtVKOR与底物结合及催化电子传递过程中的一些重要的氨基酸残基。另外，我们发现番茄VKOR(SlVKOR)具有抵抗渗透胁迫的功能。其主要结果如下:
　　(1)构建AtVKOR真核表达体系，建立VKOR还原醌活性测活方法。前期研究表明原核系统和毕赤酵母系统表达跨膜融合蛋白AtVKOR有一定的缺陷，本研究构建了酿酒酵母AtVKOR真核表达体系，利用半乳糖诱导表达并提取AtVKOR蛋白，在底物叶绿醌及还原剂DTT存在下，AtVKOR可将叶绿醌还原为酚类物质，利用高压液相色谱(HPLC)检测醌与酚的转化，以转化量表示AtVKOR活性。
　　(2)利用分子对接预测出AtVKOR还原叶绿醌活性中起关键作用的氨基酸残基。通过同源建模，我们以聚球藻VKOR的晶体结构为模板得到了AtVKOR的三维结构，以底物叶绿醌为配体，成功获得了叶绿醌与AtVKOR的分子对接模型。对接结果显示，AtVKOR结合醌时的重要氨基酸大部分是疏水氨基酸，结合植物VKOR氨基酸序列比对结果，我们预测邻近官能团萘醌环的氨基酸残基Ser77、Leu87、Phe137和Leu141在酶蛋白与底物醌结合和催化中可能起重要作用。
　　(3)醌结合位点氨基酸残基直接参与AtVKOR催化还原醌的活性。根据分子对接结果，突变表达载体上编码相应氨基酸残基的密码子，得到AtVKOR突变体。测定结果表明，突变体Ser77Ala和Phe137Ala，其还原醌活性完全丧失;突变体Leu87Ala，Leu141Ala，还原醌活性显著下降，分别只有野生型的22.78％和41.46％;另外，我们还将非极性的Leu141突变成极性的Arg，突变体Leu141Arg还原醌的活性也完全丧失。
　　(4)醌结合位点氨基酸残基与氧化底物蛋白二硫键形成有关。AtVKOR催化底物蛋白与叶绿醌之间的一系列电子传递，叶绿醌得电子还原为酚类物质，而底物蛋白失电子氧化为二硫键。利用大肠杆菌的运动性弥补实验和β-半乳糖苷酶活性实验，体内检测了醌结合位点氨基酸残基的改变对催化底物形成二硫键功能的影响。结果显示，上述氨基酸位点突变后AtVKOR氧化能力均有所下降，特别是Ser77Ala，Leu141Arg氧化活性下降幅度大，分别只有野生型的39.68％和46.03％，这与突变体还原叶绿醌活性的丧失或下降是吻合的。
　　(5) VKOR结构域中的半胱氨酸残基也与VKOR还原叶绿醌活性直接相关。先前的研究证明AtVKOR结构域中的半胱氨酸残基与催化底物蛋白二硫键形成有关，本研究发现，这些半胱氨酸突变后还原叶绿醌的活性也完全丧失，这说明这四个保守的半胱氨酸对于VKOR参与电子传递是必不可少的，它们不但在氧化底物形成二硫键中直接起电子传递的作用，也是还原叶绿醌中关键的氨基酸残基。
　　(6)番茄VKOR具有一定的抗盐胁迫和抗干旱胁迫的能力。重组表达的番茄VKOR(SlVKOR)可以提高原核细胞抵抗渗透胁迫和盐胁迫的能力。构建正义、反义SlVKOR基因植物表达载体并转化野生型番茄植株，获得T2代转基因的番茄纯合体，盐胁迫和干旱胁迫后，与野生型相比，正义植株体内ROS积累量少，超氧化物歧化酶(SOD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)等活性氧清除酶类的活性高，SlVKOR的过量表达提高抵抗盐胁迫和干旱胁迫能力，而反义植株与正义植株相反，降低了番茄抵抗渗透胁迫能力。因此，SlVKOR参与渗透胁迫的应答机制。