CYP2E1固有活性与二乙基亚硝胺所致大鼠肝纤维化的相关性

肝纤维化是肝脏纤维结缔组织异常增殖和积累的病理状况，是慢性肝病发展到肝癌的必经阶段。肝癌是一种常见的恶性肿瘤，严重威胁着人类的生命安全。肝癌形成过程复杂，流行病学研究表明亚硝胺、乙肝病毒、黄曲霉毒素、酒精损伤、家族遗传病等都是诱发肝癌的因素。
　　二乙基亚硝胺是亚硝胺家族的典型代表，对人与动物都具有致癌作用。二乙基亚硝胺是前致癌物，经CYP2E1代谢产生乙醛与烷基化产物，产物与DNA加合诱导基因突变，造成肝脏损伤。
　　本研究室前期研究发现，肝癌患者肝纤维化组织 CYP2E1活性显著升高。推测 CYP2E1活性升高可能与肝纤维化的形成有关，这在已有的研究中未见报道，故我们希望通过建立肝纤维化大鼠模型来探究 CYP2E1活性与大鼠肝纤维化的关系。
　　本研究拟建立肝纤维化大鼠模型，通过分析二乙基亚硝胺在大鼠体内的毒代动力学参数与肝纤维化评分及肝纤维化程度指标的相关性，以探明 CYP2E1固有活性与二乙基亚硝胺所致大鼠肝纤维化的相关性。
　　1.方法
　　1.1.建立大鼠肝纤维化模型
　　1.1.1.实验动物
　　取约六周龄，体重170±10 g的健康雄性SD大鼠30只，饲养一周，以适应新环境。将大鼠随机分组，空白对照组10只、模型组20只。
　　1.1.2.给药方案
　　前4周大鼠腹腔注射二乙基亚硝胺50 mg/kg，每周2次，5~12周改为每周1次，对照组大鼠注射相同体积的生理盐水，在12周处死全部大鼠。
　　1.1.3.肝纤维化相关指标的测定
　　采用试剂盒测定大鼠血浆中谷草转氨酶，谷丙转氨酶的含量，采用免疫组化的方法测定增殖细胞核抗原阳性率，抗原Ki67阳性率以及胎盘型谷胱甘肽硫转移酶光密度值。
　　1.1.4.肝纤维化评分
　　采用HE和Masson染色法对肝脏切片进行染色，根据Ishak评分法对病理结果进行评分，将肝纤维化严重程度分为0~6分。
　　1.2.大鼠二乙基亚硝胺毒代动力学
　　大鼠腹腔注射50 mg/kg二乙基亚硝胺前采空白血样，注射后于1、4、10、25 min及1、2.5、4.5、7、10、24 h眼眶采血，分离血浆保存待测，血样中二乙基亚硝胺浓度采用HPLC-UV法进行检测。用DAS2.0软件分析二乙基亚硝胺浓度得到毒代动力学参数。
　　1.3.大鼠CYP2E1固有活性与肝纤维化程度的相关性
　　肝纤维化大鼠第1周二乙基亚硝胺的毒代动力学参数体现其 CYP2E1的固有活性。肝纤维化大鼠血浆中 AST、ALT含量反映肝损伤程度，间接反映肝纤维化程度。肝组织中PCNA、Ki67阳性率和GST-P光密度值以及Ishak评分可直接反映肝纤维化程度。做相关性分析可以得出大鼠 CYP2E1固有活性与肝纤维化程度的关系。
　　1.4.统计方法
　　采用 DAS2.0软件对不同时间点二乙基亚硝胺浓度分析，得到毒代动力学参数，峰浓度（Cmax）与达峰时间（Tmax）以实测值表示。采用SPSS17.0统计软件对各项数据资料进行统计学分析。检验水准α为0.05。
　　2.结果
　　2.1.肝纤维化大鼠模型
　　2.1.1.肝纤维化大鼠模型成功率
　　第12周20只模型组大鼠肝脏全部发展为纤维化，大鼠肝脏纤维化模型成功率为100％。
　　2.1.2.大鼠体重和肝脏指数
　　第12周模型组大鼠平均体重为（336.6±43.6） g，明显低于对照组大鼠（468.9±46.0）g（P<0.05）；模型组大鼠肝脏指数为（4.4±1.0）%，明显高于对照组大鼠（2.8±0.3）%（P<0.05）。
　　2.1.3.肝纤维化相关指标
　　第12周肝纤维化模型组大鼠血浆中AST含量为（58.61±15.50）U/L，明显高于对照组（14.64±3.47）U/L（P<0.001）。模型组大鼠血浆中 ALT含量为（27.76±8.76）U/L，明显高于对照组（11.05±2.24）U/L（P<0.001）。模型组大鼠肝脏中PCNA阳性率为（52.10±17.82）%，明显高于对照组（12.70±10.22）%，（P<0.001）。模型组大鼠肝脏中Ki67阳性率为（70.30±20.83）%，明显高于对照组（14.30±8.56）%（P<0.001）。纤维化模型组大鼠肝脏中 GST-P光密度值为67.71±16.13，明显高于对照组45.20±10.32（P<0.001）。
　　2.2.二乙基亚硝胺毒代动力学
　　2.2.1.第1周二乙基亚硝胺毒代动力学参数
　　二乙基亚硝胺在肝纤维化模型组大鼠体内第1周CL为（0.17±0.02）L/h， AUC0-t为（254.99±30.62）mg/L*h，AUC0-∞为（293.75±37.54）mg/L*h，t1/2为（3.05±0.59）h，Cmax为（65.92±8.58）mg/L，Tmax为（0.12±0.11）h，Vd为（0.75±0.10）L/kg。
　　2.2.2.第12周二乙基亚硝胺毒代动力学参数
　　二乙基亚硝胺在对照组大鼠体内 CL为（0.18±0.03） L/h， AUC0-t为（254.26±22.07）mg/L*h，AUC0-∞为（285.04±43.45）mg/L*h，t1/2为（2.88±0.85） h，Cmax为（57.36±3.84）mg/L，Tmax为（0.15±0.10）h，Vd为（0.72±0.13）L/kg。二乙基亚硝胺在肝纤维化模型组大鼠体内 CL为（0.12±0.05）L/h，AUC0-t为（451.37±135.06）mg/L*h，AUC0-∞为（494.88±190.62）mg/L*h， t1/2为（5.62±2.70） h，Cmax为（59.83±7.04）mg/L，Tmax为（5.62±2.70）h，Vd为（0.85±0.25）L/kg。
　　2.2.3.二乙基亚硝胺毒代动力学参数的差异性比较
　　第12周二乙基亚硝胺在肝纤维化模型组大鼠体内CL明显低于对照组大鼠（P<0.001），t1/2明显高于对照组大鼠（P<0.01），AUC0-t与 AUC0-∞明显高于对照组大鼠（P<0.001），Cmax、Tmax及Vd与对照组大鼠相比无明显差异（P>0.05）。对照组大鼠与模型组大鼠第一周时二乙基亚硝胺毒代动力学参数无明显差异（P>0.05）。
　　2.3.肝纤维化大鼠CYP2E1固有活性与肝纤维化程度的相关性
　　模型组大鼠第1周时的毒代动力学参数可以反映大鼠的CYP2E1固有活性， Ishak评分可以直接反映大鼠肝脏的纤维化程度，AST与ALT可以间接反映大鼠肝脏的纤维化程度。做相关性分析得到AUC0-t和AUC0-∞与肝纤维化Ishak评分呈负相关（r=-0.470，P<0.05，n=20）。CL与AST呈正相关（r=0.598，P<0.01， n=20），AUC0-t与AST呈负相关（r=-0.745，P<0.001，n=20），AUC0-∞与AST呈负相关（r=-0.591，P<0.01，n=20）。CL与ALT呈正相关（r=0.481，P<0.05， n=20），AUC0-t与ALT呈负相关（r=-0.470，P<0.05，n=20），AUC0-∞与ALT呈负相关（r=-0.455，P<0.05，n=20）。我们发现大鼠在第1周CYP2E1固有活性与大鼠形成肝纤维化严重程度有关，大鼠CYP2E1固有活性越高，在12周时形成的肝纤维化更加严重。
　　3.结论
　　3.1.首次报道二乙基亚硝胺在正常大鼠和肝纤维化大鼠体内毒代动力学。
　　3.2.肝纤维化大鼠CYP2E1代谢二乙基亚硝胺活性降低。
　　3.3.大鼠CYP2E1固有活性与肝纤维化呈明显相关性。